陈天娇，朱平

    工程酵母细胞高压破碎、蛋白低温保藏和去糖基化处理对7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影响

    陈天娇，朱平

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生和计划生育委员会天然药物生物合成重点实验室

    紫杉醇主要来源于红豆杉，作为一种“重磅炸弹”式的抗肿瘤药物，自 1992 年 12 月被美国 FDA 批准上市以来，一直是销售额最大的植物抗肿瘤药。但由于紫杉醇的天然含量极低，约占含量最高的树皮部位的万分之二，加之红豆杉生长缓慢，早期从野生红豆杉中获取紫杉醇曾给红豆杉资源造成毁灭性破坏。目前主要依靠化学半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培虽然对保护野生红豆杉资源具有积极意义，但栽培红豆杉中紫杉醇含量低微的本质没有发生改变。另一方面，红豆杉中存在着大量的紫杉醇结构类似物，其中包括含量数十倍于紫杉醇的 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脱除木糖基之后形成的 10-去乙酰紫杉醇仅需在 C10 位乙酰化即可产生紫杉醇[1]。如能将这类副产物转变成紫杉醇，不仅可以减少其对环境的污染，还可以“变废为宝”，大大提高红豆杉资源的利用率。脱除木糖基可用化学法或生物酶法来完成，其中后者的专一性强、环境友好。但由于天然细胞中 β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用筛选得到的微生物直接进行转化效率不高[2-3]，本实验室已尝试用基因工程方法解决这一问题。我们已从具有转化 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为 10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了 7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，该酶隶属于糖基水解酶的第 3 家族，是一种全新的和双功能的 β-木糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶，能高效且专一性地水解包括 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在内的 7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相应的 7-羟基紫杉烷。已对该酶及其重组菌开展了酶的表征、高密度发酵与生物催化等研究[4-6]。本文报告工程酵母细胞高压破碎条件、蛋白低温保藏和去糖基化处理对 LXYL-P1-2 酶活性的影响，为利用纯化的重组酶进行酶结构与功能关系等的研究提供保障。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 重组毕赤酵母 GS115-3.5K-P1-2 由本实验室构建。

    1.1.2 试剂与溶液 β-木糖苷酶通用的生色底物对硝基苯基-β-D-木糖苷(p-nitropheny-β-D-xylopyranoside，PNP-Xyl)和标准牛血清蛋白(BSA)均购自美国 Sigma 公司；蛋白酶抑制剂 Cocktail Set III(无EDTA)购自美国 Merck Millipore 公司；糖苷内切酶Endo Hf 购自美国 New England BioLabs 公司；蛋白定量染色液购自美国 Bio-Rad 公司；配制以下蛋白纯化溶液： ......