程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张弢，王旻

    单克隆抗体电荷异构体分离方法优化

    程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张弢，王旻

    210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院(程洪杰、王旻)；210042 南京，江苏先声药业有限公司(程洪杰、马珂、秦国宏、张道平、张弢)

    单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体[1]。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺[2]，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段[1]。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。电荷异构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。由于这些异构体可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性地识别和分离电荷异构体是至关重要的。基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超过一个 pH 单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除[3]。因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构体含量与原研药保持一致。

    在众多分离手段中，离子交换层析被认为是最有前景的方法[4]。有研究表明，依赖 pH 变化的分离方式比依赖离子强度变化的分离方式效果更好[5-6]。近年来不断有研究者通过 pH 梯度洗脱方式分离电荷异构体。Pabst 等[7]通过控制缓冲液中 Tris、双 Tris 丙烷、组氨酸、乙醇胺的比例，而 Farnan 和 Moreno[8]通过调节缓冲液中哌嗪、咪唑和 Tris 的比例，均实现了 pH 梯度洗脱，成功分离出抗体的电荷异构体，但整个工艺较为复杂，pH 控制不稳定。近些年，置换色谱凭借其出色的分离能力，已成功被应用于分离抗体电荷异构体、寡糖、多肽、小分子化合物。但商品化的阳离子层析置换剂 Sachem Expell SP1 成本较高，且伴随着碱性异构体的洗脱过程亦有部分置换剂被洗脱[9]，也带来一定的安全隐患，此外，置换序列的监测是一项耗时、难度较大的工作，这些均阻碍其应用到生产中。

    本课题组经 CHO 细胞表达，Protein A 亲和层析、SP-FF 阳离子层析已制备纯度达 95% 以上的单克隆抗体 IgG1 ......