刘虹，王佳平，辛冰牧，邵荣光

    GSK3β抑制剂SB216763通过激活小鼠成纤维细胞自噬相关蛋白抑制TGF-β1诱导的I型胶原产生

    刘虹，王佳平，辛冰牧，邵荣光

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所(刘虹、邵荣光)；100094 北京，中国航天员科研训练中心(王佳平、辛冰牧)

    探讨 SB216763 对小鼠成纤维 3T3-NIH 细胞 I 型胶原表达和分泌的影响。

    使用转化生长因子 TGF-β1 诱导胶原的表达，使用天狼猩红染色试剂盒及 Western blot 检测 I 型胶原和自噬相关蛋白的表达。

    给予 TGF-β1 后，细胞培养上清中胶原含量从(11.85 ± 0.90)mg/ml 上升至(16.70 ± 0.67)mg/ml(1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验细胞 3T3-NIH 细胞购于中国医学科学基础医学研究所细胞培养中心，细胞使用DMEM培养基，10% FBS 培养，每隔 2 天传代一次，细胞培养条件为 37 ℃、5% CO2。

    1.1.2 主要试剂 DMEM 细胞培养基、进口血清FBS 和胰酶购于美国 Gibco 公司；天狼猩红染色试剂盒购于英国 Biocolor 公司；SB216763、雷帕霉素及抗小鼠 p62 购于美国 Sigma-Aldrich 公司；抗小鼠 β-actin、Beclin-1、Vps34 抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；I 型胶原抗体购于英国 Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度定量试剂盒购于碧云天生物科技研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 天狼猩红染色检测 I 型胶原 根据文献[6]的方法，使用转化生长因子 TGF-β1 以不同的剂量(0、5 和 10 ng/ml)作用于小鼠成纤维细胞 48 h 后，收集细胞，4 ℃、600 ×离心 20 min 后取上清，按照胶原检测试剂盒说明书检测胶原含量。

    1.2.2 Western blot 取适量培养细胞，加入 RIPA 裂解液后振荡混匀，冰上放置 30 min，间或振荡；4 ℃、4560 ×条件下离心 15 min。取上清，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，其具体步骤参照说明书进行。调节蛋白至相同浓度，分装，加入 5 倍上样缓冲液，96 ℃变性 10 min，一部分用于 SDS 电泳，一部分–80 ℃保存[3]；使用 Amersham 显色系统显色 ......