罗睿，徐建，魏玉珍，李海龙，刘红宇，苏静，赵莉莉，张玉琴，余利岩

    以蛋白激酶A为靶点的抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

    罗睿，徐建，魏玉珍，李海龙，刘红宇，苏静，赵莉莉，张玉琴，余利岩

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所药用微生物菌种保藏管理中心

    建立以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型，应用该模型筛选具有特异性酶活抑制活性的微生物发酵液粗提物样品。

    以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板，扩增目的基因片段，构建表达载体 pET43.1a-，在大肠杆菌中克隆表达了重组 MTB PknA 蛋白；采用三步级联的反应方法，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸这一反应最大吸光值波长的变化，建立和优化蛋白激酶A 抑制剂高通量药物筛选模型。

    成功构建了表达载体 pET43.1a-；建立了稳定灵敏，可用于靶向结核分枝杆菌蛋白激酶A 的抗结核药物高通量筛选模型；利用该模型对 4000 个微生物发酵液粗提物样品进行筛选，最终得到 21 个抑制蛋白激酶A 活性的阳性样品，阳性率 0.53%；以耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌为检定菌，平板纸片法检测阳性样品的抗分枝杆菌活性，然后对阳性样品的细胞毒性和酶活抑制特异性进行评价后，最终得到 8 个阳性样品，其中 I10AA-02916、I09AA-02717、I09AB-02729、I08AB-00801 这 4 个阳性样品酶活抑制特异性、抗菌活性均较好，且细胞毒性较低。

    建立了高稳定性的以蛋白激酶A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型，应用该模型所得到的发酵液阳性样品值得进一步研究。

    环AMP依赖性蛋白激酶类； 药物评价，临床前； 抗结核药； 高通量筛选

    结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康、流行最广的感染性疾病之一[1]。20 世纪初，人们曾一度乐观地估计，将在全球范围内消灭结核病。然而，结核病不仅没有被消灭，反而在 20 世纪中后期卷土重来，并陆续产生多重耐药、广泛耐药和超级耐药结核分枝杆菌等变种[2-5]。据 WHO 统计，2012 年全球新发 860 万结核患者，并有 130 万人死于结核病。结核病合并艾滋病的流行趋势也是未来需要面对的挑战[6-7]。因此，寻找能有效治疗多重耐药结核、广泛耐药结核等新型有效的抗结核药物显得尤为迫切。

    蛋白激酶 A(protein kinase A，PknA)是结核分枝杆菌产生的 11 种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinases ......