张志来，陈建华

    定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展

    张志来，陈建华

    210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院

    定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复改造遗传多样性，结合文库高通量筛选而获得理想性状生物体的过程，现已成为在基础生物学和应用生物学领域应用最广泛和最有效的技术之一。目前已成功应用于蛋白质的研究和开发。蛋白质在生物催化、生物医药等领域具有广泛的应用。如何提高目的蛋白的产量、改善蛋白质的理化特性以及构建具有新催化活性的蛋白质以满足日益增长的需求是亟待解决的问题。而定向进化技术的发展为实现这样的目的提供了强有力的技术支持。本文就定向进化技术在蛋白质开发中的应用进行了综述。

    1 定向进化技术

    与理性突变方法相比，定向进化技术具有独特的优势：突变体的构建无需受蛋白质结构信息的限制。早先的定向进化技术的靶标多数是单个蛋白，通过随机或定点插入突变，获得稳定性更好或催化活性更高的突变体以适应工业化要求。而近年来的趋势则转向于对代谢途径甚至是基因组水平进行改造，以创造新型全细胞催化剂用于合成有价值的生物产品[1]。

    目前，比较经典的定向进化技术有易错 PCR 技术和 DNA 改组技术等，而新兴的技术则是在这两种技术的基础上改进发展起来的。

    1.1 易错 PCR 技术

    易错 PCR 是利用 Taq DNA 聚合酶，或改变 PCR 反应体系的条件，在 DNA 聚合过程中随机引入错配碱基，其突变位点发生在分子内部，是应用最早、最成熟的一种定向进化方法[2]。易错 PCR 无需改变基因的长度，突变频率可以根据反应条件进行相应的控制，并且能有效地获得理想突变体，在蛋白质定向进化中得到了广泛的应用。但是易错 PCR 只能发生点突变，而且获得活性突变体的效率比较低，因此其应用受到了一定的限制。在易错 PCR 基础上，Gratz 和 Jose[3]发明了重叠延伸蛋白域文库法(PDLGO)，它克服了易错 PCR 突变率低的缺陷，可以在预期的区域内进行随机突变。

    1.2 DNA 改组

    DNA 改组，又称有性 PCR 技术，是由 Stemmer[4]于 1994 年首先提出，后经不断改进，现已成为比较完善的定向进化技术。它将单个基因或同源性较高的多个基因通过 DNase I 随机片段化，藉由小片段之间的同源性，互为模板，互为引物重新组装成大片段。然后，加入特异性引物进行有引物 PCR 扩增全长嵌合体基因，结合高通量筛选方法选择具有功能改进或全新功能的突变体 ......