张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星

    猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究

    张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星

    目的 通过优化猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色鉴定及分子鉴定获得高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌基因组水平的研究提供材料。

    猴头菌； 原生质体； 单核体； 荧光染色

    猴头菌(Hericium erinareus)是一种珍贵的食药用真菌，含有萜类、酚类等生物活性物质，对提高人体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、调节中枢神经等具有显著功效。尤其是猴头菌子实体产生的神经保护成分猴头菇菌素广受国内外关注。目前国内外对猴头菌的研究多集中在活性成分分离及其药理活性方面[1-2]，但对猴头菌分子生物学尤其是活性成分的生物合成机制报道较少。基因组学技术的发展为深入研究猴头菌次生代谢产物的合成提供有力工具。目前猴头菌的功能基因组学研究尚未开展。猴头菌子实体一般由二倍体菌株发育而来，含有两套不同的染色体，基因组复杂度较高，测序解析困难。因此获得单核体是基因组测序工作的前提和基础。在获得单核体的方法中，原生质体单核化法所获得的单倍体菌株不经过重组，因而更能完整地展示二倍体亲本的遗传信息[3]。然而单核体的再生有一定的困难，所以需要高产量的原生质体为基础。酶解法是制备原生质体的一种常用方法，而酶的种类、酶解条件、培养基的成分[4]都对原生质体的释放有很大的影响。本文优化了猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色及分子鉴定获得了高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌基因组水平的研究提供材料。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌种 发酵的猴头菌菌丝由中国科学院微生物所提供，经 PDA培养基纯化获得，并经 DNA序列鉴定属于猴头菌。

    1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，水 1000 ml，pH=5.5。葡萄糖培养基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水 1000 ml，碳源筛选时分别以麦芽糖、蔗糖、淀粉替代培养基中的葡萄糖。综合培养基：在葡萄糖培养基中分别加入马铃薯、燕麦、麦麸各 200 g。除培养基筛选实验，其余实验材料均用添加马铃薯的培养基进行培养。PDP培养基：马铃薯培养基中除去 KH2PO4和MgSO4·7H2O。再生培养基：马铃薯培养基中加入KCl，使终浓度为 0.6 mol/L。

    1.1.3 试剂 溶壁酶购自广东微生物所；蜗牛酶及纤维素酶购自北京佳辰科技有限公司；DAPI荧光染色剂购自瑞士 Roche公司；CTAB植物基因组 DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司 ......