邹有土，白羊，葛平辉，阮卡，陈星

    ·技术与方法·

    阿达木单抗ELISA定量检测方法的建立

    邹有土，白羊，葛平辉，阮卡，陈星

    治疗性单抗药物已经成为生物医药的重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。随着研究的深入及技术的进步，治疗性单抗药物呈现出良好的发展势头[1-2]。阿达木单抗是一种全人源的 IgG1型单克隆抗体，可靶向作用于在自身免疫疾病发病机制中起重要作用的促炎细胞因子——人肿瘤坏死因子(TNF-α)。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多关节型幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis，PsA)和强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者关节滑液中均发现 TNF-α水平增高，这与炎症发生和关节破坏密切相关[3-4]。阿达木单抗可特异性、高亲和地与TNF-α结合，并阻止它与细胞表面 TNF-α受体 p55和p75结合，从而拮抗 TNF-α的生物活性，减少表皮厚度和炎性细胞浸润[5-6]。

    由于阿达木单抗的特殊疗效及其巨大的市场份额，许多医药企业通过生物仿制药的方式加入到该产品的开发和生产中。在开发和生产过程中必须建立起严格高效的质量控制方法，而含量的测定是重要的项目控制之一。本研究以hTNF抗原为包被抗原，羊抗人 IgG-HRP为检测抗体，建立了定量测定阿达木单抗的 ELISA方法，并对该方法进行了方法学研究。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    阿达木单抗注射液(修美乐，Humira)购自美国雅培制药；牛血清白蛋白(BSA)购自美国 Roche公司；hTNF抗原购自美国 BD Pharmingen公司；TMB购自美国 Fisher Scientific公司；羊抗人 IgG(H+L)-HRP购自美国 Pierce公司；吐温 20为美国 Amresco公司分装；其他常规试剂为国产分析纯产品；苯乙烯 96孔板购自丹麦 Nunc公司；Sunrise型酶标仪购自瑞士 Tecan公司。阿达木单抗发酵液、空白细胞株(不含阿达木单抗基因的细胞株)发酵液、辅料溶液(按阿达木单抗注射液处方的辅料组成制得的空白对照品溶液)均为本公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 试剂配制 将阿达木单抗注射液稀释至 1 ng/ml，之后再对倍系列稀释到所需浓度 ......