杜郁，贾晓健，袁芳，王丽，王丽非，洪斌

    人抑瘤素M在大肠杆菌中的表达、纯化及其对胆固醇代谢关键基因表达的影响

    杜郁*，贾晓健*，袁芳，王丽，王丽非，洪斌

    目的 构建人抑瘤素 M(OSM)的原核表达载体，通过表达及纯化获得重组蛋白，为深入研究 OSM 的功能及机制奠定基础。

    方法 利用 PCR 技术，从质粒 pOTB7-hOSM 中扩增出人OSM 蛋白编码序列，与原核表达载体 pET-16b 连接，构建表达质粒 pET16b-OSM。在 BL21(DE3) 工程菌中表达目的蛋白，Western blot 法检测 OSM 蛋白的表达。为提高OSM 的可溶性表达，采用共表达分子伴侣的方法提高其上清产物的表达量。将放大发酵的产物处理后，经镍亲和层析法纯化，获得 OSM 成熟蛋白，SDS-PAGE 电泳分析蛋白纯度。MTT 法检测 OSM 对 A375 细胞的抑制活性，实时荧光定量 PCR 试验分析 OSM 对 HepG2 细胞中胆固醇代谢相关基因(LDLR、ABCA1、ApoA-I 和 SR-BI)表达的影响。

    结果 成功构建 pET16b-OSM 原核表达质粒，酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在 E. coli BL21(DE3) 中实现了目的蛋白的表达，通过共表达分子伴侣质粒 pTf16，进一步提高了可溶性表达的水平。放大发酵产物经镍亲和层析纯化获得 OSM 成熟肽，电泳检测纯度大于 98%。MTT 法检测所制备的 OSM 蛋白抑制 A375 细胞生长的 EC50为315 ng/ml。mRNA 水平检测证实 OSM 能剂量依赖地上调胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体和 ABCA1 基因的表达。

    结论 成功构建了 OSM 的原核表达载体，获得了具有生物学活性的目的蛋白，证实了其对胆固醇代谢关键基因转录的影响，为下一步功能及机制研究奠定基础。

    抑瘤素 M； 原核表达； 分子伴侣； 胆固醇代谢

    抑瘤素 M(oncostatin M，OSM)最早是从U937 组织型瘤细胞的培养上清中分离出的一种对A375 黑色素瘤细胞有生长抑制作用的细胞因子，主要由活化的 T 淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞表达产生。OSM 同 IL-6、IL-11 和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等细胞因子都属于糖蛋白 130(glycoprotein 130，gp130)细胞因子家族，该家族成员的生物活性具有多样化的特点，在细胞分化、增殖，血细胞生成，免疫调节，炎症应答和协调细胞因子间功能等方面发挥着广泛而重要的作用[1] ......