郭连宏，张洋，鲍勇刚，白利平，姜蓉，李元

    依博素生物合成基因ste22的异源置换研究

    郭连宏*，张洋*，鲍勇刚，白利平，姜蓉，李元

    目的 依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖，具有显著抗类风湿性关节炎的作用，我们研究已确定了该多糖的生物合成基因簇(ste)。为了对依博素结构进行改造以提高其生物活性，对其生物合成基因 ste22 进行了异源置换研究。方法 采用 PCR 扩增方法从乳酸菌获得了编码葡萄糖糖基转移酶的基因 gtf，通过基因同源重组双交换，从链霉菌中置换了 ste22 基因。采用白细胞介素-1 合成酶活性测定方法及小鼠巴豆油急性炎症模型，初步确定了基因置换株的依博素衍生物生物活性。

    异源基因置换； 基因 gtf； 基因 ste22； 链霉菌； 乳酸菌

    类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，严重影响身体健康，目前尚缺乏有效治疗手段。本课题组从链霉菌 139(Streptomyces sp.139)的发酵液中成功分离获得了一种微生物新型胞外多糖，命名为依博素[1]。药效学证明其对大鼠 II 型胶原诱导的类风湿性关节炎模型和佐剂型类风湿性关节炎模型均有显著抑制作用[2]。作用机制研究证明其对白细胞介素-1β(interlukin-1β，IL-1β)等主要炎症细胞因子的生成及信号传导途径有明显抑制活性[3]，依博素有可能发展为治疗 RA 的新药。

    我们的研究已确定依博素的生物合成基因簇(ste)由 27 个开放阅读框架组成[4]，对基因编码产物的生物功能已进行了较深入研究[5-7]，其中基因ste22 编码产物被确认为鼠李糖糖基转移酶[8]。糖基转移酶在微生物胞外多糖(EPS)的生物合成过程中起重要作用，在多糖生物合成基因簇中引入异源糖基转移酶基因有可能改变多糖结构获得新衍生物，并可验证被置换基因功能及多糖构效关系。鉴于乳酸菌与链霉菌同属革兰阳性菌，且其多糖生物合成基因簇中葡萄糖糖基转移酶基因研究较深入，因此本文采用 PCR 扩增方法，从产生胞外多糖的乳酸菌基因组获得其多糖生物合成簇的葡萄糖糖基转移酶基因。以缺失基因 ste22(编码鼠李糖糖基转移酶)的依博素产生菌突变株为受体菌，通过基因同源重组双交换将葡萄糖糖基转移酶基因 gtf置换至依博素生物合成基因簇中，Southern 杂交验证获得了基因置换菌株 Streptomyces sp.139 (gtf-22)，分离纯化了该菌株产生的胞外多糖EPS-22g，结果表明其单糖组分与依博素相比葡萄糖比例有显著提高，体内外活性研究结果初步证明该衍生物较依博素活性有所提高 ......