陈成娟，王伟

    生物发光共振能量转移技术在蛋白酶活性检测中的应用

    陈成娟，王伟

    作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验实验室/国家卫生和计划生育委员会天然药物生物合成重点实验室

    生物发光共振能量转移(BRET)是 20 世纪中叶在海洋生物，例如维多利亚水母和软体珊瑚虫海肾中发现的一种自然现象[1]，能量从生物发光蛋白如荧光素酶(供体)转移到荧光物质(受体)。在软体珊瑚虫海肾中海肾荧光素酶将腔肠素氧化，发出波长为 480 nm 的光，与近距离的海肾绿色荧光蛋白之间发生一个非辐射的能量转移，发出 509 nm的光[1-3]。实际上，共振能量转移理论早在 1948 年就已经被 F?rster 提出并被称为共振能量转移(F?rster resonance energy transfer，FRET)[4]。根据供体不同，共振能量转移分为以荧光物质如荧光蛋白[5]、有机分子[6-7]、纳米无机荧光材料等为供体的 FRET 以及荧光素酶或者发光蛋白为供体的 BRET[8]。共振能量转移发生时，供体发出的部分光转移到受体荧光蛋白，受体发出波长更长的光。共振能量转移只有在受体分子的吸收光谱与供体分子的发射光谱有效重叠后才能发生。其发生取决于供体分子与受体分子的距离(一般在 1 ～ 10 nm)和两者的相对方向[9-10]。BRET 首次报道是用于检测细菌节律钟蛋白 KaiB 相互作用[8]，随后被广泛用于研究蛋白-蛋白相互作用(多数是蛋白偶联受体的二聚化和寡聚化的相关研究)[11-13]以及活体成像[14-16]等，同时 BRET 在蛋白酶检测及药物筛选中也发挥了巨大的作用[17]。

    1 BRET 体系的特点

    BRET 不需外源光激发，其背景极低，灵敏度高。与FRET 相比，BRET 能量供体为催化腔肠素发射荧光的荧光素酶，不需要外源光源激发荧光供体，更利于能量的定量转移，并且避免了 FRET 中强光源激发引起的很多副反应[18]，如光漂白[9]，直接激发受体，激发环境中的发光物质，损伤组织，光源光强被组织吸收而弱化等；同时 BRET 的另一个优势是可以分别对能量供体和受体进行定量[19]。BRET分析技术应用于生物体内生理活动的分析时不会对细胞组织造成有害影响，且可以实时监测，信号产生迅速，适合于高通量的筛选实验[20]。因此，在一些需要低背景和高灵敏的实验中，BRET 显示出巨大优势，在相关研究中发挥了重要的作用，解决了一些重要的分析问题 ......