张永欣，赵斐，王臻，张瑞欣，周金明，岑山

    ·论著·

    以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒的构建

    张永欣*，赵斐*，王臻，张瑞欣，周金明，岑山

    目的构建以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒用于药物作用机制的快速鉴别。

    方法通过使用分泌型荧光素酶(Gluc)序列替代流感病毒HA 基因，并利用表达质粒反式提供 HA 蛋白，借助甲型流感病毒 WSN 反向遗传学产毒系统，构建带有报告系统的单轮感染流感病毒。

    结果首轮接种单轮感染流感病毒的细胞上清中可以检测到 Gluc 信号，但检测不到病毒滴度，而在第二轮感染的细胞上清中检测不到 Gluc 信号，表明该单轮感染病毒在感染过程中能够分泌 Gluc 蛋白并且不能产生具有感染性的子代病毒颗粒。通过对复制动力学和时相的观察，明确了单轮感染病毒的生活周期，同时结合 4 种已知作用机制的抗流感药物的阻断实验结果，证明该系统可以用来快速、有效地鉴别药物的作用机制。

    结论成功构建了以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒，该系统可以用于抗病毒药物作用机制的快速鉴别。

    流感病毒 A 型；药物评价， 临床前；单轮感染病毒；Gluc 报告基因

    www.cmbp.net.cn中国医药生物技术， 2016， 11(4)：300-307

    甲型流感病毒是急性呼吸道传染性疾病的主要病原体之一。临床上预防和治疗流感的手段主要有疫苗和抗流感药物，但是由于流感病毒具有极强的重组变异和抗原漂移能力，严重地限制了流感疫苗的免疫保护作用。同时，目前的流感病毒流行株对临床一线抗流感药物也产生了不同程度的耐药[1-2]，因此亟需寻找新的抗流感药物靶标和发展新型抗流感病毒药物。

    抗流感病毒药物研发过程中，药物作用机制研究是其中一个重要方面。由于流感病毒复制周期比较短，病毒的多轮感染对药物作用环节的确定造成较大干扰。因此，通过构建单轮感染流感病毒，对其药物作用时相进行观察，可以快速、有效地鉴别药物的作用机制；同时，将单轮感染模型应用于高致病性流感毒株，可以降低操作的危险性以及对实验条件的要求。

    甲型流感病毒的生活周期包括病毒吸附，脱衣壳，病毒核糖核蛋白(vRNPs)转运入核，基因组转录和复制，病毒蛋白合成，vRNPs 核输出、组装和释放等过程[3]。病毒颗粒经过 HA 介导[4]的吸附、进入等环节后在细胞质中完成脱衣壳过程，病毒 vRNPs 释放进入细胞质，随后入核，在核内启动转录和复制过程。转录产生的病毒 mRNA 翻译成病毒蛋白 ......