孙江漫，胡林萍，李承文，陆宏卿，薛卫霞，程涛，缪为民

    白血病染色体基因断裂(易位)FISH探针的研究

    孙江漫，胡林萍，李承文，陆宏卿，薛卫霞，程涛，缪为民

    目的 自主研制可以检测白血病染色体基因断裂的双色 FISH 检测试剂盒。方法 根据染色体基因图谱，选定合适的 BAC 克隆重叠群分别作为基因断裂点 5' 端探针和 3' 端探针。采用缺口平移法，制作出 5' 端标记绿色荧光素，3' 端标记红色荧光素的探针。用双盲法检测白血病临床样本 40 例，对自制探针和同类进口探针在各项技术参数上进行对比研究。结果 自制探针检测基因断裂(易位)的阴、阳性率与同类进口产品完全相符；在 Spectrum Green 和 Cy3? v1 通道中，自制探针的平均荧光信号强度比进口探针明显提高(自制探针分别为：2930.5 ± 38.00，2766 ± 59.54；进口探针分别为：2239 ± 45.13，1986 ± 59.56；1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂及仪器 质粒纯化试剂盒购于德国 Qiagen 公司；R I、ssDNA、tRNA 购于美国 Sigma 公司；DNA polymerase I、人 cot-DNA、SSPE 购于美国 Invitrogen 公司；Spectrum Green-dUTP 购于美国 Abbott Molecular 公司；PromoFluor-555-dUTP 购于美国 PromoKine 公司；进口探针购于美国 Vysis 公司。Axioimager Z2 型荧光显微镜为德国Carl Zeiss 公司产品；ThermoBrite 原位杂交仪为美国Abbott Molecular公司产品。

    1.1.2 标本来源 选择在本院就诊的血液病患者骨髓样本。

    1.2 方法

    1.2.1 制片过程 取骨髓样本，用 0.075 mol/LKCl 低渗去除红细胞，细胞甩片后用甲醇室温固定过夜，第 2 天用 2% 甲醛固定 5 min 后，储存于–20 ℃ 70% 乙醇中，使用时依次在 70%、85%、100% 梯度乙醇中脱水，晾干后 FISH 检测备用。

    1.2.2 探针设计 使用 UCSC Genome Bioinformatics 数据库定位检索细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)克隆[6]。选择定位于 11q23 包含基因断裂点 5'端的 BAC克隆重叠群(图 1，包括 3 个 BAC 克隆) ......