王小怡，王博，王雪伟，高哲，郭大玮

    生物素标记的甲基化间区位点扩增技术分辨不同组织DNA甲基化水平方法初探

    王小怡，王博，王雪伟，高哲，郭大玮

    DNA 甲基化是重要的表观遗传修饰之一。在哺乳动物细胞中，DNA 甲基化参与基因表达和染色质结构的调控[1]，与多种癌症的发生发展相关[2-3]。DNA 甲基化在胚胎发育早期、个体生长发育及多种疾病的发生发展过程中起着重要的作用，是当前表观遗传研究领域的热点之一[4-5]。分析基因组中甲基化水平能够了解不同组织之间、正常与疾病状态以及不同年龄引起的甲基化水平的差异。Frigola 等[6]通过扩增甲基化间区位点(amplification of intermethylated sites，AMIS)分析了结肠癌组织与癌旁组织基因组中 CCCGGG位点的甲基化水平。该法通过 [α-33P]dATP 进行放射自显影，对机体有很大的损害。有文献报道可以用生物素标记的引物进行 PCR 扩增[7]，因此本研究尝试用生物素标记引物进行 PCR 扩增代替放射性核素法分析基因组 DNA 甲基化水平(图 1)。

    图 1 生物素标记引物进行 PCR 扩增分析基因组 DNA 甲基化水平原理示意图(双线代表基因组 DNA)

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 SPF 级 SD 大鼠 9 只，标记为 1 ～9 号，雄性，体重 180 ～ 200 g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(许可证编号：SCXK-(军)2012-0004)，饲养于山西医科大学实验动物中心。

    1.1.2 主要试剂和仪器 限制性内切酶 Rsa I 和 CviQ I、T4 连接酶均购自美国 NEB 公司；PCR 产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；rTaq 聚合酶购自日本 Takara 公司；化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TC-96/G/H(b)B 型基因梯度扩增仪购自杭州博日科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 9 只大鼠随机分为两组，1 ～ 4 号正常饲养；5 ～ 9 号脑部局部双侧给予 2 nmol/L 的 δ-阿片受体激动剂 1 μl。一周后处死大鼠，取心、脑、肝、肺、肾、脾、胰组织 ......