陈世明，章瑾，宣丹英，毛钟鸣，陈鹏翾

    一种长期培养人神经干细胞的新方法

    陈世明，章瑾，宣丹英，毛钟鸣，陈鹏翾

    神经干细胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新能力和多向分化潜能。神经干细胞的移植对治疗神经系统的损伤和神经退行性疾病都有直接或间接的作用[1-3]，临床研究和应用对神经干细胞的需求日益迫切。但由于技术原因，神经干细胞在体外的培养存在易分化和易死亡的技术难题。目前，神经干细胞的获取途径主要是从多个胚胎或流产胎儿中分离并进行有限的培养扩增，但胚胎或胎儿源的贫乏及各胚胎或流产胎儿之间的差异性使得神经干细胞来源混杂，无法达到标准化，成为神经干细胞临床化的重要限制因素。本实验从流产胎儿中分离出神经干细胞，并在体外长期规模化培养、扩增，为神经干细胞的研究提供稳定的、用之不竭的细胞来源，为临床神经干细胞移植奠定基础。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    DMEM/F12(1∶1)培养基购自美国 Hyclone 公司；重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)、B27 添加剂、N2 Supplement、TP-EDTA均购自美国 Gibco 公司；肝素钠和胰酶抑制剂购自美国Sigma 公司；庆大霉素购自上海现代哈森(商丘)药业有限公司；其他实验材料有巢蛋白、多聚赖氨酸、维生素 E、腐胺、亚硒酸钠、人转铁蛋白、黄体酮、L-谷氨酰胺、维生素 C 葡萄糖苷。

    1.2 方法

    1.2.1 培养基配制 取 1000 ml DMEM/F-2(1∶1)培养基，加入 5.9 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)搅拌均匀，制成基础培养液，使溶液 pH 值控制在 7.0～7.1，分别加入 200 μg 肝素钠、30 μg 维生素 E、25 mg 重组人胰岛素、1.6 mg 腐胺、6 μg 亚硒酸钠、5.5 mg 人转铁蛋白、7 μg 黄体酮、300 mg L-谷氨酰胺、20 μg rhEGF、20 μg rhbFGF、50 mg 维生素 C 葡萄糖苷、40 000 IU 庆大霉素，混匀。

    1.2.2 神经干细胞的分离 取孕 16周的人流胎儿脑组织，在无菌条件下分离出海马组织，D-Hank’s液清洗，眼科剪剪成小组织块，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制剂终止其消化。用 100 目不锈钢细胞过滤筛过滤，去除大组织块，离心收集沉淀细胞。将沉淀细胞重悬于神经干细胞培养基，制成单细胞悬液。

    1.2.3 神经干细胞原代培养 经过细胞计数后以(1～2)×106/ml 接种到 T75 细胞培养瓶中 ......