赵琼，蒋建东，张靖溥

    人肝细胞核因子4基因II型启动子的双向转录调控的特性

    赵琼，蒋建东，张靖溥

    目的探讨人肝细胞核因子 4α 基因 II 型启动子(hHNF4α-P2)双向调控基因表达的作用。

    方法克隆 hHNF4α-P2 –23 ～ –1291(1268 bp)序列；构建由该段正、反序列驱动的荧光蛋白真核表达载体；将其通过细胞转染和显微注射导入细胞或斑马鱼体内，考察其表达的时空特性。通过 DNA 缺失实验和序列预测分析寻找hHNF4α-P2 的正、反向核心启动序列。

    结果hHNF4α-P2 的正向和反向 DNA 序列(–23 ～ –1291)均可驱动其下游报告基因在人正常肝细胞 L02 及肝癌细胞 Huh7 中表达；在斑马鱼体内正向启动子驱动的红色荧光蛋白基因可在耳石、嗅泡和神经丘等感觉器官中高表达，在肝区可见较弱的红色荧光。反向启动子驱动的绿色荧光蛋白基因可在血细胞、神经细胞、体节及脊索等组织表达。该启动子正链存在一段核心序列，反链存在两段核心序列。

    结论首次发现 hHNF4α-P2 的 –23 ～ –1291 序列具有双向调控基因在不同组织表达的功能。

    肝细胞核因子 4α； 基因表达； 斑马鱼；双向启动子

    肝细胞核因子 4α(hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)位于人基因组第 20 号染色体上，是一类高度保守的核受体超家族成员，对于肝细胞分化和功能[1]、胰腺 β 细胞功能的维持[2]等发挥重要的调控作用。HNF4α 基因座含有相距约 46 kb 的两个启动子区域 P1 和 P2，其转录调控具有明显的时空差异性。在小鼠胚胎肝脏中，P2 转录的 HNF4α亚型水平远高于 P1 的产物[3-4]，而成年肝细胞中则以 P1 表达的 HNF4α 为主[3-5]，两者在胃、肾脏、小肠、胰脏 β 细胞等组织的表达也有差异[4]。这两种启动子的差异性调控还表现在诸多的肿瘤中[6-7]。因此，研究 HNF4α 启动子转录调控的复杂性对于全面了解该蛋白在胚胎发育及病理过程中的作用具有重要意义。另外，双向启动子是基因调控多样性和协调性的重要机制，这种基因现象在脊椎动物中普遍存在[8]，但实验证据相对较少。本文报道了人 HNF4α II 型启动子(HNF4α-P2)区域约 1.3 kb序列在斑马鱼胚胎中的双向启动子功能。

    1 材料与方法

    1.1 试剂及材料

    胰蛋白胨及酵母提取物购自英国 Oxoid 公司；琼脂糖和转染试剂 Lipofectamine2000 购自美国 Invitrogen 公司；DNA 片段凝胶回收试剂盒、Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、DTT、dNTP、T4 DNA 连接酶、pMD19-T 载体均购自日本Takara 公司；质粒中提试剂盒及细胞基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；细胞培养所需的 DMEM 培养基及胎牛血清购自美国Gibco 公司；细胞培养瓶购自德国 Nunc 公司；人肝细胞系 HepG2 细胞、L02 细胞和缺失了 CMV启动子序列的 pdCMVP-EGFP-N1 由本实验室保存；pIRES2-DsRed 由杭州师范大学张亮惠赠；斑马鱼(Daniorerio)AB 系由清华大学生命科学院孟安明教授惠赠 ......