陈世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛钟鸣，陈鹏翾

    人成体神经干细胞长期培养后遗传稳定性研究

    陈世明，章瑾，王卓然，宣丹英，毛钟鸣，陈鹏翾

    神经干细胞因具有自我更新、增殖和多向分化潜能[1]，神经干细胞移植已成为治疗神经系统的损伤和神经退行性疾病的新方法[2-5]。但神经干细胞的体外培养仍存在许多技术难点，培养过程中细胞易分化或凋亡，难以长期培养[6]。且培养过程中易产生遗传漂变、微生物污染、细胞交叉污染等问题[7]。培养传代时，一般使用化学性酶，如胰蛋白酶等分离神经干细胞球，酶的多次使用对长期培养的神经干细胞可能产生累积损伤[8-11]。因此，经体外长期培养后神经干细胞的增殖分化能力，尤其是遗传信息稳定性依然未知。我们以物理方法切割分离神经干细胞球，并改良了神经干细胞培养液，成功实现神经干细胞的体外长期培养[12]。但该方法是否存在遗传不稳定性仍需要进行研究。本文通过对体外传代培养不同时间的神经干细胞进行短串重复序列(STR)分析和端粒酶活性鉴定，为神经干细胞的体外长期培养的遗传稳定性提供实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    DMEM/F-12(1∶1)培养基购自美国 Hyclone 公司；人重组表皮细胞生长因子(rhEGF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)、N2 Supplement 均购自美国 Gibco公司；16 位点 STR 试剂盒和 2800 M DNA 标准品购自美国 Promega 公司；TeloTAGGG 端粒酶 PCR-ELISA 试剂盒购自瑞士罗氏公司；巢蛋白购自武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 神经干细胞培养 取流产胎儿脑组织，在无菌条件下分离出海马组织，D-Hank’s 液清洗，眼科剪剪成小组织块，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制剂终止其消化。用 100 目不锈钢细胞过滤筛过滤，去除大组织块，离心收集沉淀细胞。将沉淀细胞重悬于神经干细胞培养基，制成单细胞悬液。经过细胞计数后以(1 ～ 2)× 106/ml接种到 T75 细胞培养瓶中。将细胞培养瓶置于 5% CO2、37 ℃ 培养箱中进行培养。每天观察细胞生长状态，3 ～ 4 d半量更换神经干细胞培养基一次。每月用自行研制的干细胞球切割器切割分离传代一次。

    1.2.2 神经干细胞球及分化细胞观察 分别取神经干细胞球悬液滴于经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，置 37 ℃ 培养箱中培养 24 h，使细胞黏附于载玻片上，倒置显微镜下观察结果并照相记录 ......