陈翔，张佳琦，汪泽，许旭，朱滨

    荧光定量法测定DNA熔解温度

    陈翔，张佳琦，汪泽，许旭，朱滨

    DNA 熔解温度(Tm)指 DNA 双链变性过程中一半双链解离为单链的温度[1]，是 DNA 片段的一个重要特性。准确测定 DNA 片段 Tm值，是分子生物学实验方法(如PCR 检测技术、核酸杂交检测技术等)建立的基础，在疾病的分子诊断领域具有重要现实意义[2-4]。影响 DNA 片段Tm值的因素有很多，如 DNA 片段的长度、DNA 片段的GC% 含量[5]、盐离子浓度、pH 等[6]。传统测定 DNA 片段 Tm值的方法多用紫外分光光度法[7-9]，该方法有一定的局限性，溶液需要量大，操作起来不方便。利用荧光试剂(如 SYBR Green I)与双链 DNA 结合后荧光大大增强的特点，采用荧光定量法可以较好解决这些问题。用荧光定量法测定 DNA 样品在含有 SYBR Green I 溶液中的熔解曲线，根据其导数曲线熔解峰对应的温度可以确定 DNA 样品的 Tm值。荧光定量 PCR 仪溶液需求量小，不需太多操作，能很好地控制反应的温度，进行实时自动化检测[10-11]。本文用荧光定量法测定不同大小、不同 GC% 含量 DNA片段的 Tm值并研究了其影响因素，显示该法可用于实际样品测定。

    1 材料与方法

    1.1 仪器与试剂

    FQD-48A 型荧光定量 PCR仪、TC-XP-D 型 XP 基因扩增仪、HB-100 型恒温金属浴为杭州博日科技有限公司产品；Cary 100 型紫外可见分光光度计为美国安捷伦科技有限公司产品；OD-1000+ 超微量分光光度计为南京五义科技有限公司产品。

    SYBR Green I(10 000 ×)购自厦门致善生物科技股份有限公司；lambda DNA、DMSO、Tris 盐酸盐、Tris 碱均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；K2HPO4·3H2O、KH2PO4均为国产分析纯试剂。

    1.2 方法

    1.2.1 不同大小、不同 GC% 含量 DNA 片段的制备 大片段 DNA 的 GC% 含量大多没有显著差异，选择商业化lambda DNA 产品。150～300 bp 的不同 GC% 含量 DNA片段的制备是选择人基因组中不同 GC% 含量的基因(TPMT、CY、APOE)，采用体外扩增并纯化。25 bp 的不同 GC% 含量 DNA 片段(Oligo A、Oligo B、Oligo C)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并纯化 ......