刘玉斌，于爱平，刘农乐，吴祖泽，靳继德

    HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量

    刘玉斌，于爱平，刘农乐，吴祖泽，靳继德

    100022 北京工业大学生命科学与生物工程学院(刘玉斌)；100850 北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所(刘玉斌、于爱平、刘农乐、吴祖泽、靳继德)

    建立 HPLC 技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素(EH)含量的方法，用于监测发酵过程中EH 的表达量变化与诱导时间的关系，使 EH 产量最大化。利用 HPLC 技术建立 EH 的检测方法，通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察，确立该方法的可行性；利用该方法对 EH 样品进行稳定性考察，并对酵母发酵上清液进行跟踪检测。实现了对发酵过程中发酵上清液中 EH 的实时监测。EH 在 214 nm 处有较强的特异性吸收峰，其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系，2= 0.9995，EH 线性浓度范围在 0.012 ~ 4.8 mg/ml。该测定方法具有很好的精密度，样品多次重复测定的 RSD 值为 1.4227%；加标回收率在 95% ~ 98%。应用该方法对 EH 样品的稳定性测定结果显示，样品 4 ℃保存稳定性较好，24 h 内样品主峰面积百分比 > 95%，在 20 ℃条件下，8 h 内样品稳定性良好，主峰面积百分比 > 95%。该方法准确度高、重复性好，进行测定时，可根据 EH 的特异吸收峰，对发酵过程中发酵上清液中 EH 含量进行实时定量测定。测定结果显示，在一定时间范围内，EH 的表达量与诱导时间成正相关。本研究建立了 HPLC 技术检测 EH 含量的方法，该方法可用于发酵过程中 EH 的实时定量监测，使 EH 的产量达到最大值，为 EH 的临床样品制备提供有力支持。

    酵母表达系统； 重组新蛭素； 高效液相色谱； 实时监测

    血栓性疾病发病率逐年增高，严重威胁着人类的健康和生命。抗凝类药物是预防和治疗血栓性疾病的重要手段，但抗凝药普遍存在的出血副作用给临床用药造成极大的不便。重组新蛭素(EH)是运用生物工程技术在水蛭素的氨基末端连接可被凝血因子Xa/XIa 识别切割的多肽而成，该多肽封闭了水蛭素的抗凝活性，但经过凝血因子 Xa/XIa 酶解后，EH 可产生抗血栓的作用。EH 这种结构特点和作用机制减少了系统出血的风险，提高了抗栓的特异性和作用效率[1-2]。作为一种新型抗凝药物，新蛭素的研发将对血栓性疾病的预防和治疗起到重要作用。EH 采用毕赤酵母表达系统进行生产[3]。在发酵生产过程中，为了监测目的蛋白表达与甲醇诱导之间的关系 ......