柳常青，王霞，汲生芝，公伟广，张贵民

    甘精胰岛素外源性DNA残留量的荧光染色法检测研究

    柳常青，王霞，汲生芝，公伟广，张贵民

    273400 临沂，山东新时代药业有限公司(柳常青、王霞、汲生芝、公伟广)；276006 临沂，鲁南制药集团股份有限公司(张贵民)

    甘精胰岛素是一种通过基因工程重组技术，利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物，是具有长效作用的人胰岛素类似物。该药物在皮下注射后立即聚合，溶解度降低，形成微沉淀物，使吸收、分解和作用时间延长，相当于基础胰岛素的无峰值分泌，发挥长效平稳降血糖的作用[1]。宿主细胞残留 DNA 因有潜在的致癌或传染风险，是基因工程重组产品需要严格控制的杂质。《中国药典》2015 年版收载了 2 种外源性 DNA 残留检测方法：DNA 探针杂交法和荧光染色法。DNA 探针杂交法操作周期较长，干扰因素多，重复性较差，宿主菌 DNA 的种属和质量直接影响检测结果的准确性[2]。荧光染色法是利用双链 DNA 荧光染料与双链 DNA 特异结合形成复合物，在波长 480 nm 激发下产生超强荧光信号，用荧光酶标仪在波长 520 nm 处进行检测，在一定的 DNA 浓度范围内以及荧光染料过量的情况下，荧光信号与 DNA 浓度成正比[3-4]。荧光染色法操作简单快速，不需要宿主 DNA 作为模板，能够检测出重组制品中全部 DNA 污染，因而可广泛用于重组蛋白药物残余 DNA 的检测。

    由于荧光试剂盒的缓冲液 pH 值接近甘精胰岛素等电点，容易导致样品溶液浑浊进而影响检测，同时从相关文献可知胰岛素或其类似物本身可能对荧光法检测产生干扰[5-6]，本文对甘精胰岛素 DNA 检测的样品处理方法进行详细研究，并对检测方法进行了方法学验证。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 原料药 重组甘精胰岛素原料药由山东新时代药业有限公司制备，批号：D012、D013、D020、D022、D033、D034。

    1.1.2 仪器 荧光酶标仪 Spectra Max ?Gemini EM 及 SoftMax Pro 软件为美国 Molecular Devices 公司产品；DK-98-1 型电热恒温水浴锅为天津市泰斯特仪器有限公司产品；Z323K 型高速冷冻离心机为德国 Hermle 公司产品。

    1.1.3 实验试剂 荧光试剂盒 Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA assay kit 购自美国 Invitrogen 公司；PCR 级重组蛋白酶 K 购自瑞士 Roche 公司 ......