许雪梅，刘建

    体外肿瘤细胞迁移和侵袭定量方法的建立

    许雪梅，刘建

    侵袭是恶性肿瘤最重要的特征之一。肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，部分细胞被血液、淋巴液带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，这一过程即为肿瘤的迁移和侵袭[1]。在肿瘤研究中，肿瘤细胞迁移和侵袭实验是研究肿瘤转移相关特性的重要方法[2-3]，也是抗肿瘤药物筛选的常用手段[4-6]。建立合适的肿瘤细胞迁移和侵袭模型，并建立简便、准确的定量方法，对于肿瘤研究具有重要的意义[7]。

    传统的定量方法是将迁移或侵袭的细胞用结晶紫染色，在显微镜下对几个代表性视野中的染色细胞进行拍照和计数[8-9]，耗时长、通量低、准确度差。本研究中，我们在传统的模型基础上，建立了一种结晶紫染色后进行醋酸脱色、酶标仪读取吸光度值的定量方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    人纤维肉瘤细胞 HT-1080、小鼠成纤维细胞 NIH/3T3以及人乳腺癌细胞 MCF-7 均购自美国 ATCC；MEM 和DMEM 细胞培养液、胎牛血清、PBS、matrigel、transwell 细胞培养小室(8 μm 孔径 PET 膜)、T-25 细胞培养瓶、96 孔透明板等均为康宁公司产品；结晶紫染料购自上海碧云天生物技术有限公司；醋酸购自国药集团；SpectraMax M4 多功能酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 HT-1080 细胞用添加 10% 胎牛血清的MEM 进行常规培养。MCF-7 细胞用添加 10% 胎牛血清及 0.01 mg/ml 的人重组胰岛素的 MEM 进行培养。NIH/3T3细胞用添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养。细胞每隔 2 ～3 天换液，在达到 80% ～ 90% 汇合度时进行传代。

    1.2.2 细胞迁移和侵袭实验 matrigel 使用前置于冰上，于 4 ℃ 冰箱融化过夜。所有接触 matrigel 的试剂、耗材、器皿等都置于冰上预冷。将 matrigel 用无血清培养液稀释至 200 μg/ml，上下吹打混匀。取 100 μl 稀释后的 matrigel包被溶液，小心加入到侵袭组的 transwell 细胞培养小室中间。将包被 matrigel 的 transwell 置于 37 ℃ 孵育 1 h 以上。迁移组的小室不用包被 matrigel。HT-1080、NIH/3T3 和MCF-7 细胞用胰酶消化 ......