舒雄，杰永生，郑蕊，陈磊，靳少锋，綦惠，孙磊

    离心重力诱导脂肪间充质干细胞向软骨样细胞分化

    舒雄，杰永生，郑蕊，陈磊，靳少锋，綦惠，孙磊

    100035 北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所

    探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对 Wnt/β-catenin 信号通路的影响。

    通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000 ×)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞，并利用荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 Sox 9 基因的上调表达来筛选条件，将培养的 P3代 hADSCs 分 3 组，对照组(不干预处理)、离心重力组和 TGF-β3 组(加入 TGF-β3 成软骨诱导剂)，持续培养 21 d 后，通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定，DMMB 法测定胞外基质中 GAG 含量，荧光定量 PCR 测定 II 型胶原基因表达，Western blot 进一步检测对照组和离心重力组中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和 p-GSK3β 蛋白的表达。

    加载最适的离心重力(2500 ×，30 min)刺激 hADSCs 后，培养 24 h，Sox 9 的 mRNA 和蛋白表达显著上调。阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示，离心重力组和 TGF-β3 组中软骨表达呈阳性。GAG 实验结果显示，TGF-β3 组促 GAG 分泌的能力优于离心重力组(1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂 人脂肪组织来源于北京知音创美医疗美容门诊部吸脂者，女性，抽吸部位为腹部，术后无菌保存。I 型胶原酶、胰酶、Trizol 试剂、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清(FBS)购自美国 Gibco 公司；阿利辛蓝染料、苏木精-伊红染料购自北京索莱宝生物科技有限公司；地塞米松、ITS+ 购自美国 Sigma 公司；TGF-β3 购自Pepro tech 公司；cDNA Synthesis SuperMix 和UltraSYBR Mixture 购自日本 Takara 公司；Sox 9、β-catenin 和 p-GSK3β 抗体购自美国 CST 公司；HRP-羊抗鼠 IgG 和 HRP-驴抗兔二抗购自 Jackson 公司。

    1.1.2 仪器 CO2细胞培养箱购自美国 Shellab 公司；往复式真空泵购自上海益化真空设备有限公司；倒置相差显微镜购自日本 Olympus 公司；冷冻大容量离心机购自湘仪离心机仪器有限公司；荧光定量 PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司；Nanodrop ND-2000 分光光度计购自美国 Thermo Fisher 公司 ......