高鹏，李玉霞，贾凡，扈江伟，乔雪辉，王炜，凌焱，陈惠鹏

    合成生物学旨在以人工手段制造生物系统[1]，其中一个重要发展方向是模拟和新建生物信号通路并实现新的生物学功能。合成生物学经过多年的快速发展，产出了新型的研究工具和治疗方案[2]。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CAR)修饰的 T 淋巴细胞(CAR-T)就是利用合成生物学思路搭建信号通路形成的治疗方案，其应用已经在癌症治疗方面展现出巨大的前景并得到美国FDA 批准进入临床应用[3]。CAR-T 按照合成生物学的基本设计原则在安全性和可控性方面不断取得新的进展[4]。

    急性淋巴细胞白血病(ALL)的 20% 儿童患者和 65% 成人患者存在化疗耐药性，导致疾病复发[5]。新型的治疗方案需要绕过药物抵抗才能显著提高治疗指数。由此，细胞治疗作为一种新型的治疗方案由于出色的疗效令人瞩目，其有效缓解率优于现有的经典疗法[6]。

    通过人工修饰的方式可以改变 T 淋巴细胞的免疫杀伤靶向性，即在 T 细胞上修饰人造的免疫受体从而特异识别肿瘤细胞并激活 T 细胞，其高效的靶向性使 T 细胞毒性特异性针对肿瘤细胞，选择性杀伤肿瘤细胞，避免正常组织受到影响[7]。人造的嵌合抗原受体通常包括胞外的抗体来源单链可变结构域(single-chain variable fragment，scFv)和胞内信号转导分子。对于 ALL 细胞，CD19 表面抗原分子在高达 95% 的 B 细胞肿瘤上表达[8]。而且这种高表达是特异性的，不在正常的非造血细胞上表达，造血细胞中也仅仅在 B 淋巴细胞系表达，这使得 CD19 分子成为一个极具吸引力的靶向治疗抗原[9]。单纯的 CD3ζ 信号不足以激活 T 细胞发挥杀伤作用，根据 T 细胞激活的双通路理论，还需要添加共刺激信号分子，比如 4-1BB 分子[10]。

    在本项研究中，我们探究了靶向 CD19 分子的嵌合抗原受体修饰的 T 淋巴细胞对于 CD19 细胞的特异性杀伤作用。结果表明，抗 CD19 CAR-T 细胞能够特异性地被 CD19 表型阳性的细胞激活，并且在较低的效靶比时即对靶细胞产生较强的杀伤作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    大肠杆菌 DH5α、293T 细胞、K562 细胞、K562CD19+细胞为本实验室保存。RPMI1640、DMEM、青霉素/链霉素、胎牛血清均为美国 Gibco公司产品；DNA 聚合酶、DNA marker、限制性内切酶为美国 NEB 公司产品；质粒大提试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；淋巴细胞分离液 Ficoll-Paque PLUS 购于美国 GE 公司；聚凝胺、聚乙烯亚胺为美国 Sigma-Aldrich 公司产品；IL-2 ELISA kit为美国 BD 公司产品；Cyto Tox96?非放射性细胞毒性检测试剂盒购于美国 Promega 公司 ......