郭，白羊，章永垒，李义嘉，黄奋飞，陈胜亮，王明灶，陈星

    HPLC法快速检测重组人神经生长因子原液中醋酸残留量

    361009 厦门，未名生物医药有限公司

    神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是最早发现的神经营养因子，其在神经细胞的生长、发育、分化、存活和损伤神经修复中起着重要的作用[1]。目前，临床采用鼠颌下腺提取的 NGF 用于各类神经损伤的修复，疗效显著[2]。由中国仓鼠卵巢细胞(CHO 细胞)表达的重组人神经生长因子(rhNGF)相较于鼠神经生长因子(mNGF)具有活性更高、免疫风险更低的特点，具有广阔的市场前景[3]。

    CHO 细胞属于外源细胞，其重组表达的蛋白、单克隆抗体等生物制品中可能会出现病毒污染，采用适宜的手段(如低 pH 孵育法)进行病毒灭活能有效提高生物制品的安全性[4]。在 CHO 细胞重组表达 rhNGF 工艺中，使用醋酸调节 pH 进行病毒灭活，再进一步超滤即得 rhNGF 原液。但醋酸属于国际人用药品注册技术协调会(ICH)规定的第三类溶剂，需要对产品中醋酸残留量进行检测[5]。高效液相色谱(HPLC)法是药品检测中应用最为广泛的检测方法，但目前尚无 HPLC 法检测生物制品中醋酸含量的报道。本研究提供了一种能快速检测醋酸含量的 HPLC 方法，以检测 rhNGF 原液中的醋酸残留量，为 rhNGF 的研发与生产提供技术基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    Waters e2695 HPLC 仪、Waters 2998 PAD 检测器、Empower 3 色谱工作站为美国 Waters 公司产品；十万分之一电子天平为德国 Mettler Toledo公司产品；Milli-Q 纯水器为美国 Millipore 公司产品。HP-C18 色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)购自美国 Sepax 公司；醋酸对照品、NaH2PO4均购自比利时 Acros Organics 公司，纯度 99.8%；色谱级甲醇购自美国 Fisher Chemical 公司；rhNGF 各工艺步骤原液(批次 20170401、20170402、20170403)由未名生物医药有限公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 HPLC 方法 流动相为 10 mmol/L NaH2PO4水溶液(pH 2.98):甲醇= 95:5，流速 1.0 ml/min；检测波长 210 nm；柱温 30 ℃；进样量 20 μl ......