王静斋，肖莉杰

    贝伐珠单抗仿制药生物活性测定方法的开发与应用

    王静斋，肖莉杰

    163316 大庆，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院

    贝伐珠单抗是一种人源化的抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)重组单克隆抗体，其人类免疫球蛋白 G(IgG)片段占 93%，其余的是鼠源结构，人源化部分可以使该药的1/2延长和免疫原性降低[1]。VEGF 是血管生成的重要调控因子，VEGF-A/VEGFR2 信号由 PLC-γ1 通过促进其激动激酶 C 和 Raf-MEK 信号通路，最终通过 ERK1/2 促进血管内皮细胞的增殖[2]。原位杂交研究表明，多种人实体肿瘤中均存在 VEGF mRNA 的表达[3]。肿瘤新生血管的生成是肿瘤与其周围环境中血管生长因子相互作用的结果[4]，贝伐珠单抗可以与 VEGF 特异性结合，从而阻断其与受体结合，使血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)无法活化，从而发挥抗血管生成的作用。因 VEGF 能促进异常肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移、新生和增加肿瘤血管通透性，故贝伐珠单抗结合 VEGF 后，异常肿瘤血管得到改善，肿瘤血管通透性变得正常，肿瘤部位的血管出现退化，肿瘤体积变小。同时，组织间隙的压力下降，最终使化疗药物更多更顺利地到达肿瘤部位[5]。

    单克隆抗体药物的生物活性检测是指依据单克隆抗体的预期、潜在的作用机制和工作模式(可能不限于一种)，采用相应的生物学测定方法和数据分析模式，在体外建立相应的细胞评价模型，模拟其作用机制，产生客观的全程量效反映，并将供试品与参比品进行比较，供试品测定结果应在规定的范围内。目前对于生物仿制药生物活性检测的方法主要是基于细胞检测方法，其优点是特异性高、变异度小，但其受到一些条件的限制，该方法也存在操作过程较为复杂、实验周期长、人为操作误差等缺点。而基于表面等离子共振技术建立的活性检测方法，是近几年被广泛应用于小分子制药和生物制药领域的新型检测技术，它是一种物理光学特性的分析技术，近几年也有很多这方面的报道[6-10]，该技术操作简便、实验周期短、样品消耗量低，一般仅有微克级，除了可以获得一般的亲和力信息外，还能够给出对阐述分子间结合机制更为宝贵的动力学信息，在分析测定核酸、蛋白质等大分子方面显示出了巨大的应用潜力[11-12]。本实验根据《人用重组 DNA 制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2015 版)的要求[13-14]，结合产品的特点，将人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells ......