田雷瑜，曹筠嵩，刘忞之，杨燕，王伟

    药用蛋白和工业生物催化剂通常天然含量很低，需要异源重组和表达制备，这需要发展一个稳定的、易操作的和纯化工艺可放大的高效生物表达系统。酿酒酵母细胞相对于大肠杆菌和哺乳动物具有高效的胞外分泌特点和易于遗传操作的整合型或附加体型的表达载体，其已被广泛用于重组蛋白的生物表达系统[1-2]。

    酵母细胞自身外泌并转运到细胞表面或发酵液中的蛋白可分为两大类，一类蛋白是经过经典的内质网-高尔基体途径(ER-Golgi)分泌的，这类外泌蛋白的前体通常含有信号肽，翻译后首先被定向地转运到内质网；另一类不含有信号肽的胞质蛋白如糖代谢酶、伴侣蛋白和翻译起始因子等也可以经过非经典的 ER-Golgi 非依赖分泌途径分泌到胞外，其外泌的分子机制还没有阐明[3]。许多外泌蛋白和胞内膜蛋白在合成时都依赖于其 N-端的信号肽功能元件，细胞内膜定位的蛋白尽管也经过ER-Golgi 途径转运，但是其信号肽的下游和分子内部存在穿膜肽或 C-膜定位信号(如核定位信号肽)控制蛋白的亚细胞转位[4]。分泌型的信号肽含有三个区域：N-、H- 和C- 区；N- 区含有碱性正电荷的极性氨基酸残基，H- 区含有 7 ～ 15 个疏水氨基酸残基(如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸)形成的 α-螺旋，跨越 ER 膜，促进新生肽的转位，它是信号肽的主要功能区；分泌肽的 C-区含有极性结构，作为信号肽酶 I 的识别剪切位点，其中小的和中性氨基酸残基(如丙氨酸和甘氨酸)位于剪切位点的 -3和 -1[5-6]。到目前为止，无论是在酿酒酵母还是在甲醇酵母的蛋白质工程研究中所使用最多的信号肽是酿酒酵母的交配型 α-因子的信号肽功能元件(85-aa prepro 区)[1]，其次是酿酒酵母的蔗糖水解酶的信号肽[7]。α-因子的信号肽功能元件不仅含有一个靶向内质网且由信号肽酶剪切的19 个氨基酸残基信号肽，还含有一个 66 个氨基酸残基的前导区[8-9]。因此由 α-因子引导的异源蛋白分泌表达在内质网腔内由信号肽酶剪切后，从内质网出芽并转运进入高尔基体；然后在高尔基体腔内再由内肽酶 Kex2 剪切 2 个保守的碱性氨基酸残基(Lys-Arg 或 Arg-Arg)的羧基端肽键释放前导区，最后再包装成囊泡转运到细胞表面。因此，在蛋白的分泌过程中，如果没有前导区的作用，可能会导致融合蛋白积聚在内质网；而其他信号肽(仅含有 pre 区)与 α-因子的前导区融合形成具有 α-因子野生型相似的功能元件，促进融合蛋白的外泌。可见 α-因子的前导区在由内质网到高尔基体的转位过程中起到非常重要的作用[8] ......