张育楠，陈天娇，朱平

    10-去乙酰巴卡亭III-10-β--乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析

    张育楠，陈天娇，朱平

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生健康委员会天然产物生物合成重点实验室

    利用迭代饱和突变技术进一步提高10-去乙酰巴卡亭 III-10-β--乙酰转移酶双突变体DBATG38R/F301V的活性；通过丙氨酸扫描确定DBAT 活性中心的重要位点。

    利用迭代饱和突变技术在现有双突变体 DBATG38R/F301V的基础上对 Ser396进行半饱和突变，筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体；对获得的高活性突变体蛋白进行催化 DT 的最适温度和最适 pH 测定；在最适 pH 条件下，将其分别用最适反应温度和 0 ℃温育 6 h，考察该蛋白的热稳定性；采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制。对 DBAT 底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究，分析这些位点在 DBAT 催化 10-DAB 和 DT 过程中的作用。

    获得了三突变体 DBATG38R/F301V/S396I，其催化 DT 的活性为 DBATG38R/F301V的 1.6 倍，该蛋白催化DT 的最适条件为 37.5 ℃，pH 7.5；该蛋白在 37.5 ℃静置 6 h 后催化 DT 的活力为初始值的 30%，在 0 ℃静置 6 h 后为初始值的 70%；丙氨酸扫描结果显示，Asn45在 DBAT 催化 10-DAB 和 DT 时都非常重要，而 Asn42、Glu350、Glu355和Lys389位点对催化 10-DAB 的影响更大。

    将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于 DBAT 对 DT 的催化，但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素；发现 Asn45可能是一个潜在的 DBAT 催化或底物结合位点。

    10-去乙酰巴卡亭III-10-β--乙酰转移酶； 迭代饱和突变； 高活性突变体； 丙氨酸扫描； 潜在活性位点

    10-去乙酰巴卡亭 III-10-β--乙酰转移酶(10-deacetylbaccatin III-10-β--acetyltransferase，DBAT)催化紫杉醇生物合成途径中的 10-去乙酰巴卡亭 III(10-deacetylbaccatin III，10-DAB)形成重要中间产物巴卡亭 III(baccatin III)[1]。编码DBAT 的基因最初由 Walker 和 Croteau[2]从东北红豆杉()悬浮细胞 cDNA 中克隆得到 ......