孙静静，李桂林，周雷鸣，周伟伟，赵巧辉

    目前全球越来越多的重组抗原及重组抗体用于医疗，尤其针对肿瘤、自身免疫病等难治病症，以及体外诊断试剂。越来越多的高校和企业开始重视重组蛋白新药的开发，这就要求能够快速生产足够候选蛋白用于临床前研究，因此能够快速生产毫克到克级别的重组蛋白瞬时表达体系开始得到广泛应用[1]。

    重组蛋白的生产方法主要可分为两种，一种是稳定转染(stable gene expression，SGE)，另一种是瞬时转染(transient gene expression，TGE)。稳定转染，是指外源 DNA 转入宿主细胞后将外源目的基因整合到宿主染色体中进行表达。稳定转染需要使用线性 DNA，线性 DNA 虽然较超螺旋 DNA 转入量低，但整合率高。稳定转染过程中，外源 DNA 整合到宿主细胞染色体中概率很小，只有大约 1%，且通常需要通过一些选择性标记反复筛选，才能得到稳定转染的同源细胞系。瞬时转染，是指外源 DNA/RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因的表达。因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高。在转染后 24～72 h(依赖于不同的构建)分析结果时，常常用到一些报告系统如荧光蛋白、β 半乳糖苷酶等来帮助检测。瞬时转染现已广泛应用于重组蛋白生产，不同的瞬时表达系统用于多种重组蛋白的制备。

    规模化的瞬时转染表达工艺从前期质粒 DNA 的制备、细胞的扩增到瞬时基因转染，所需时间不到一个月，即可获得毫克到克级的蛋白产物，而且瞬时转染技术的应用规模越来越大，最大已达到百升的水平[2]。与稳定基因表达相比，瞬时转染有三方面优势：第一，大大缩短了获得重组蛋白的时间[3]；第二，技术门槛较低，几乎可以在每一个细胞培养相关的实验室展开，无需特殊设备；第三，通量高，灵活性高，可以运用到多种不同重组蛋白的表达，甚至包括对宿主细胞有毒性的蛋白，而且可同时进行多种不同蛋白的表达。由于其灵活性高，瞬时转染非常适用于提供数量少但是种类繁多的蛋白小规模生产供应，或者是创新药物蛋白早期的表达筛选[4-5]。当然瞬时转染技术的表达量相对较低、放大时较大量的质粒和转染试剂会限制放大工艺的进行等问题，行业也非常关注。本文对瞬时转染技术的细胞系及构建载体、转染试剂、工艺优化及培养放大现状进行综述。

    1 表达系统

    1.1 HEK293 表达系统

    自 1977年Graham 等[6]建立人类胚胎肾(human embryonic kidney cell ......