刘雨晴，王鑫，刘凤辉，罗厚龙，徐军发

    不孕不育是指夫妻在婚后至少同居一年，有正常性生活，未采取任何避孕措施而不能生育的状态[1]。世界卫生组织(WHO)的调查数据显示，全世界有 6000 万～8000 万夫妇处于不育不孕的状态，并且由于环境、激素和相关疾病等因素的影响，不孕不育夫妇的数量日益增多[2-3]。据统计，在所有引起不孕不育的原因中，免疫学因素所致的不孕不育症占 10%～28%[4-5]。免疫性不孕不育是指由于生殖系统抗原的自身免疫或同种免疫引起的不孕不育症。据报道，79% 的不明原因的不孕妇女体内有抗精子抗体(ASAb)；在不孕不育症患者中，16% 的男性患者和 29% 的女性患者体内含有抗精子抗体，女方抗体发生率较男方高，强阳性者较 多[6]。

    精子可以成为自身抗原和同种抗原，精子抗原可以使人体产生抗精子抗体。精子多肽抗原有很多种[7-9]，其中 IZUMO 蛋白在精子表面特异性表达，精子顶体反应后可以与抗 IZUMO 抗体结合，而没有发生顶体反应的精子表面没有 IZUMO 蛋白[10]。当体内产生抗 IZUMO 抗体，精子和卵细胞的结合会受到阻碍，受精卵无法形成[11]。

    IZUMO 蛋白含有 377 个氨基酸，分为大片段胞外区域、跨膜区域和小片段胞内区域，胞外区域包含 319 个氨基酸[12]。IZUMO 蛋白在哺乳动物中具有高度保守性，IZUMO 蛋白可分为 PA、PB、PC 三个区域，其中 PB 中的免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain)具有强烈的免疫原性，是使机体产生抗体的主要区域[13]，IZUMO 蛋白 PB 中的免疫球蛋白样结构域(氨基酸 167～253)是影响精子和卵细胞结合的重要片段。

    检测抗精子抗体的方法有很多种，不同的方法，其敏感性、特异性及重复性有所不同[14-15]。ELISA 具备耗时短、可以大批量检测、费用低、技术成熟等优点，目前在国内外广泛应用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    目的基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；质粒 pET30a、菌株E.coliBL21 购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶NdeI、HindIII 和 rTaqDNA 聚合酶购于日本 Takara 公司；PCR 扩增试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、人 IgG 标准液、终止液购于北京索莱宝科技有限公司；Ni2+-NTA 凝胶层析柱购于美国 GE 公司；His-tag 小鼠单克隆抗体 IgG 购于上海碧云天生物技术有限公司；IPTG 购于北京鼎国生物工程有限公司；96 孔酶标板购于美国 Costar Inc 公司；辣根过氧化物酶标记的鼠抗人单克隆 IgG、TMB 一步法显色剂购于美国 Thermo Fisher 公司 ......