杨国威，彭世泽，赵建元，张永欣，岑山

    基于表达荧光蛋白的海分枝杆菌感染斑马鱼模型的抗结核药物评价方法的研究

    杨国威*，彭世泽*，赵建元，张永欣，岑山

    100124 北京，首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所(杨国威)； 100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所免疫生物学室(彭世泽、赵建元、张永欣、岑山)

    为了提高基于荧光检测的海分枝杆菌-斑马鱼感染模型的灵敏度和准确度，我们构建了毒力较弱的可以表达红色荧光蛋白的重组菌 Mm927-pR2HYG，建立了斑马鱼感染模型，用于抗结核药物的药效评价和筛选。

    重组菌 Mm927-pR2HYG 经受精卵卵黄囊注射感染斑马鱼幼鱼，通过测定斑马鱼致死率确定其对斑马鱼的感染性，并在激光共聚焦显微镜下观察其在斑马鱼体内的分布。同时应用荧光像素计数法对异烟肼和利福平的治疗效果进行评价。

    成功构建了表达荧光蛋白的重组海分枝杆菌 Mm927-pR2HYG 感染斑马鱼模型。异烟肼和利福平两种抗结核药物在该模型中均具有良好的治疗作用；应用荧光像素计数法和 qPCR 计数法进行的药效评价结果具有较好的一致性。

    重组海分枝杆菌 Mm927-pR2HYG 感染斑马鱼模型结合荧光像素计数法是一种快速、高效、直观的药物体内评价系统，可以用于抗结核药物的高通量筛选。

    斑马鱼； 抗结核药； 药物评价； 重组海分枝杆菌； 荧光像素计数法

    结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌感染导致的一种慢性传染病，具有较高的死亡率。全世界每年约有900 万新增病例，死亡人数高达170 万，其中肺结核位列世界十大死因之一，严重威胁着人类健康[1]。目前临床上应用的抗结核一线药物包括异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EB)、吡嗪酰胺(PZA)、链霉素(SM)五种，能够治疗 80% 以上的新感染结核患者。但是近年来随着耐药结核菌(MDR-TB 和 XDR-TB)的不断出现，导致耐药结核病的发病率日益上升[2-3]，再次让结核病患者处于无药可医的窘境，因此，发展新型抗结核药物以及更有效的疫苗迫在眉睫。

    新型抗结核药物的研发依赖于理想的动物模型和筛选方法的建立，但是由于结核分枝杆菌本身的生长特性以及较高的生物安全级别，使得结核病动物模型成为抗结核药物研发的瓶颈。常见的动物模型比如灵长类动物和啮齿类动物，由于伦理、成本以及无法完全模拟结核病在人体内的进展等原因，都不适用于大规模的体内药物筛选[4-5]。而斑马鱼因其通体透明 ......