唐铭袈，杨燕，王宇，刘忞之，王伟

    杨梅糖基转移酶UGT71AN1的克隆与功能鉴定

    唐铭袈，杨燕，王宇，刘忞之，王伟

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室

    从杨梅中分离鉴定糖基转移酶基因，进行其生物催化特性研究并应用于天然产物的糖基化修饰。

    利用转录组测序分析从杨梅叶片中获得编码糖基转移酶的 Unigenes，再结合 RT-PCR 方法克隆获得该目标基因的 cDNA，然后构建表达载体并在大肠杆菌中进行异源表达，利用体外的酶促反应进行其生物催化活性研究。

    从杨梅叶片中提取总 RNA，经转录组高通量测序和生物信息学分析获得编码糖基转移酶 UGT71AN1 基因；利用大肠杆菌进行异源表达并纯化获得融合蛋白，该酶能催化槲皮素、山奈酚、紫铆因、棕矢车菊素、原花青素和圣草酚等黄酮类化合物合成相应的葡萄糖苷；利用质谱和 NMR 对合成的糖苷进行结构鉴定，确定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷键结构。

    克隆获得一个具有催化黄酮类化合物形成葡萄糖苷的糖基转移酶基因，可利用酶促或全细胞生物催化进行黄酮类天然产物的糖基化结构修饰。

    糖基转移酶类； 杨梅属； 生物催化； 黄酮糖苷

    糖基化反应是天然产物生物合成过程中的一个重要修饰反应，结合羟基化、酰基化和甲基化反应形成植物次生代谢产物的多样性和复杂性。糖基化修饰能改善天然药物的成药性，尤其能增强其水溶性和稳定性。糖苷的形成是由糖基转移酶催化活化的核苷二磷酸单糖到不同的苷元，糖受体包括酚类、萜类、氰醇和生物碱在内所有类型的次生代谢产物[1-3]。虽然化学合成法可实现不同苷元受体的糖基化，但化学反应条件通常较为苛刻，需要保护和脱保护等多步反应，很难实现特定位置的糖基化修饰。随着高通量测序技术的发展，近年来植物转录组测序得到快速发展，极大地促进植物功能基因的克隆和功能鉴定。目前已有很多糖基转移酶得以功能鉴定，并建立了酶促反应和全细胞水平的生物催化体系并用于天然药物的结构修饰研究[4-7]。

    糖基转移酶具有良好的区域或位置选择性(regio-selectivity)和立体选择性(stereo- selectivity)[8-9]，这一催化特性是实现特定位置的糖基化修饰的优势，但对含有多个可修饰位点的天然药物(尤其是含有多羟基的黄酮类化合物)实现不同羟基多样化的糖基化修饰而言也存在很大的不足，针对每个糖基化位点需要具有特定区域选择性的糖基转移酶 ......