刘尧，林骏，梁永羿，山云，王洪涛，徐良

    论著

    噬菌体展示系统筛选糖尿病相关抗原蛋白及应用效果评价

    刘尧，林骏，梁永羿，山云，王洪涛，徐良

    用噬菌体展示系统筛选与糖尿病相关的自身抗原新表位，表达新抗原肽段并评价其在糖尿病诊断中的应用效果。

    以 I 型糖尿病血清作为靶分子，对 Ph.D.-12 噬菌体肽库进行淘选，测序淘选的噬菌体并用 ELISA 检测噬菌体与靶分子的结合效果，BLAST 分析特异性最好的表位与糖尿病的相关性，选择合适的目的基因合成重组质粒，用 Expi 293 细胞表达新抗原肽段并检测该抗原与临床血清的特异结合效果。

    共完成 2418 个噬菌体单克隆的测序，淘选出 93 种表位序列，11 种具有代表性的表位中测序超过 200 次的有 4 种，对特异性最强的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”进行分析后选择 mTOR 相关蛋白 mEAK-7 作为目的基因，抗原肽段与临床血清的特异性结合效果为：I型糖尿病阳性率为 17%，II型糖尿病阳性率为 4%。

    mEAK-7 蛋白对糖尿病血清具有一定的抗原特异性，该基因与糖尿病可能有相关性，具有很好的研究价值。

    噬菌体展示系统； 糖尿病； 自身抗体； 抗原表位

    I 型糖尿病是由于自身免疫系统错误攻击和损伤胰岛β 细胞，使胰岛素合成和分泌减少或者完全缺失的自身免疫性疾病，临床上大多数 I 型糖尿病患者可被检测到胰岛自身抗体，目前来说，GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 这 5 种胰岛自身抗体是 I 型糖尿病检测应用最广泛、最受认可、相关性最强的自身免疫标志物[1-2]。本研究通过噬菌体展示系统获得与糖尿病相关的自身抗原新表位的氨基酸序列进行自身抗原肽段的表达，评估包含抗原表位在内人工构建的蛋白多肽对于糖尿病诊断的临床价值和意义。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料、试剂

    噬菌体展示试剂盒和ER 2738 购自 Biolab 公司；培养基组分、Xgal、IPTG 购自美国 Sigma 公司；抗-M13 抗体(HRP)购自英国 Abcam 公司；限制性内切酶和Expi 293 真核表达系统购自美国 Thermo Fisher 公司；去内毒素质粒抽提试剂盒和蛋白电泳试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ELISA 板购自美国康宁公司；TMB 单组分显色液购自北京索莱宝科技有限公司；糖尿病抗体检测试剂盒、全自动免疫印迹分析仪购自深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司；全波长酶标仪购自美国 Thermo Fisher 公司；菌株DH5α 由本实验室保存；其他化学试剂为分析纯以上等级 ......