李海波，李康强，蔡鸿飞，龙海林，袁诚，许文东，张懿，杨阳

    技术与方法

    酶联免疫法检测中长链结构甘油三酯中的酶残留量

    李海波，李康强，蔡鸿飞，龙海林，袁诚，许文东，张懿，杨阳

    510240 广州，中药提取分离过程现代化国家工程研究中心/广州白云山汉方现代药业有限公司

    中长链结构甘油三酯是一种应用度较高的改性油脂，既避免了中链甘油三酯易引起酸中毒和酮血症状，又克服了长链甘油三酯免疫功能方面的缺陷和吸收缓慢的缺点[1-2]。中长链结构甘油三酯在一定程度上弥补了单一脂肪酸的供能和营养性上的缺点，也有利于氮平衡和提高单核吞噬细胞系统的功能、减轻免疫系统并发症[2-3]。结构脂质的生产方法主要有化学法和酶法等[4]。化学法往往存在着有机溶剂用量较多、反应温度高、产物难以控制等缺点。而酶法合成过程反应条件温和，安全性好，产物专一性强，能合成特殊的结构脂质，可以满足消费者在医疗和营养方面的需要，故酶法在中长链结构甘油三酯的合成应用中逐渐成为研究的热点[5]。

    脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，可催化由不同底物组成的水解和合成反应。中长链结构甘油三酯催化合成结束后需要除去脂肪酶，否则在长期存放的过程中，脂肪酶会催化酯键水解，导致游离脂肪酸的增多，以及分子内的中长链残基发生变化，严重影响产品质量的稳定性[6-7]。另外还会提高人体对中长链结构甘油三酯过敏的风险。目前，脂肪酶的测定方法有平板法(主要应用于产脂肪酶菌种的筛查及批量酶样品的快速测定，但误差较大、耗时长)，滴定法(适用于乳制品中脂肪酶活力的测定，但耗时长、误差大、会有假阳性结果、判断滴定终点困难)，色谱法(适用于脂肪酶的确证及活性精确定量，但设备昂贵，不适用于大量样品)[8-11]。国内外尚未有关于甘油三酯中的低含量脂肪酶检测的报道，本研究通过制备脂肪酶抗体-脂肪酶抗原-酶标抗体复合物，与 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应显色的原理，建立中长链结构甘油三酯中酶残留量的酶联免疫测定法，并重点验证该检测方法的稳定性、准确性，以期为监控中长链结构甘油三酯的质量稳定性提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 仪器与试剂

    Multiskan FC 酶标仪购自美国赛默飞公司；BJPX 生化培养箱购自山东博科科学仪器有限公司；CS-101-A电热鼓风干燥箱购自上海昕仪仪器仪表有限公司。

    脂肪酶酶联免疫分析试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；中长链结构甘油三酯样品经酶法酯交换反应实验制备所得。

    1.2 方法 ......