田东芳，崔香玲，周睿，张永欣，马雪梅，岑山

    ·论著·

    CRISPR系统相关蛋白的纯化与活性分析

    田东芳，崔香玲，周睿，张永欣，马雪梅，岑山

    100124 北京工业大学生命科学与生物工程学院(田东芳、马雪梅)；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所免疫室(田东芳、崔香玲、周睿、张永欣、岑山)

    对 CRISPR 相关蛋白 Cas3、Cas6 及 Cas9 进行表达纯化，并测定其活性。

    在体外构建带有目的基因的质粒，导入大肠杆菌表达系统，通过大肠杆菌的过表达，裂解并提取蛋白，利用 His 标签，可将目的蛋白纯化出来；通过 3 种 Cas 蛋白对不同核酸的切割，分别设计 3 种核酸底物，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终确定 Cas 蛋白的活性。

    成功表达并纯化得到 Cas3、Cas6 及 Cas9 3 种蛋白，并根据其蛋白特性，与相应的核酸底物进行孵育，在电泳后通过凝胶成像，可观察到 3 种蛋白均具有活性。

    表达纯化的 Cas3、Cas6 及 Cas9 具有生物学功能，为其功能机制研究奠定了基础。

    CRISPR； Cas3； Cas6； Cas9

    规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated proteins，CRISPR-Cas)是细菌和古生菌用来抵抗外源核酸的适应性免疫系统[1]。CRISPR 位点是由细菌自身的重复序列及用于识别外源核酸的间隔序列组成。CRISPR 免疫系统执行功能，需要经历 3 个阶段：适应、表达及干扰。在适应阶段，细菌将来源于噬菌体或者外源质粒的核酸序列作为间隔序列，整合到 CRISPR 位点的重复序列之间。这些间隔序列执行序列记忆功能，以保证在之后的相应噬菌体或质粒的入侵过程中进行针对性的防御[2]。在表达阶段，所有重复序列和间隔序列作为一个整体，被转录成 crRNA 前体，最终被相应 Cas 蛋白处理成成熟的 crRNA[3]。在干扰阶段，crRNA 作为向导，与入侵的核酸互补配对，同时由相应的 Cas 蛋白进行识别以及切割外源入侵核酸[4]。

    根据基因组成、Cas 蛋白与基因结构之间的序列相似性，目前将 CRISPR 系统分为两类(1 类和 2 类)，其中 1 类中包含 3 种型别(I 型、III 型和 IV 型)，2 类中也包含 3 种型别(II 型、V 型和 VI 型)以及 19 个亚型[5] ......