关丹丹，赫卫清

    作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室

    抗生素是临床上应用非常广泛的一类药物，许多感染性疾病因此得到有效控制。但是致病菌的耐药性也越来越普遍，已经给人类健康带来极大挑战，所以研发出新的抗感染药物刻不容缓。现在已知的抗生素大部分来源于放线菌，这类菌可以产生大量具有抗感染、抗肿瘤和抗氧化等生物活性的次级代谢产物，约 40% 的临床药物都是来源于这些次级代谢产物或其衍生物。然而，在放线菌中大多数生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters，BGCs)在正常的实验室培养条件下无法表达，这就需要新的技术来开发这些沉默 BGCs 的生物合成潜力。

    微生物在实验室中的纯培养是研究微生物的基础，微生物培养条件的优化是发掘微生物次级代谢产物最基本的方法[1]。随着生物信息学和合成生物学的发展，已经出现多 种激活沉默 BGCs 的方法，包括在培养基中添加化学诱导物[2]、共培养[3]、核糖体工程和转录因子激活[4-5]，还有正调控基因或者途径特异性激活基因的过表达法[6-8]。对于难以利用生物信息学预测的 BGCs 可以通过随机构建基因文库的方法发掘次级代谢产物[9]。除此之外，天然产物生物合成途径的异源表达在药物发现中受到越来越多的关注[10-11]。虽然异源表达能绕过原有的调控网络来激活沉默基因簇，但是由于多种原因，在异源宿主中的表达产物的产量通常较低。本文总结了利用重构生物合成基因簇来激活沉默基因簇及提高其表达水平的方法，包括 DNA 组装、启动子工程等方法。

    1 DNA 组装

    DNA 组装技术是完成人工组合生物元件和模块化的关键环节，包括基于限制酶的组装技术、体内外同源重组和重叠延伸 PCR 等。在酵母和芽孢杆菌体内的重组可以用于更复杂的 BGCs 组装[12]。自 DNA 组装技术发明以来，可以进行 BGCs 中多个基因的突变、插入和缺失，从而提高次级代谢产物产量和获得新的衍生物等[13]。下面从生物合成途径的重构和修饰两个方面介绍在放线菌中激活沉默基因簇的最新进展。

    1.1 途径重构

    1.1.1 “自上而下”的途径重构 许多微生物的次级代谢产物都是非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)/聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)类型的化合物，其 BGCs 的大小可达 100 kb 以上。利用酶切连接方法往往无法直接对完整的 BGCs 进行有效克隆 ......