吴敬智，缪着，马波，刘馨

    作者单位：650500 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室(吴敬智、缪着、马波、刘馨)；650106 昆明时光肌生物技术有限公司(马波、刘馨)

    近年来，随着再生医学的发展，细胞治疗得到越来越多关注，冷冻保存方案在再生医学和细胞治疗方面有巨大潜力。冷冻保存是利用低温保存结构完整的活细胞来实现后续细胞治疗的迫切需要。目前冷冻保存技术的使用和生物库行业的需求在不断增加，迫切需要现代化和成熟的冻存手段来改善细胞冻存质量，为细胞治疗提供保障。早期研究发现了解细胞冻存损坏机制和冻存条件对冻存效果至关重要。本文对悬浮细胞冻存机制、冻存过程中细胞骨架的受力和细胞器的损伤变化；影响悬浮细胞活性的冻存因素；以及造血干细胞、外周血单个核细胞和自然杀伤细胞的深低温保存研究进展，细胞冻存后的生理生化特点进行综述。

    1 细胞冻存和复苏基本原理

    1.1 细胞冻存

    低温下，活细胞中的生物和化学反应都会大大降低，为细胞长期冻存提供了可能。冷冻对大多数活生物体都是致命的，细胞冻存是利用冷冻保护剂来降低冰点，缓慢冻结细胞的过程中，细胞内水分透出细胞，使细胞冻结中冰晶形成减少，从而避免了由于冰晶形成对细胞中生命活性物质的一系列损伤。此外，细胞冻存的理论认为，细胞在低温环境可以抑制细胞的呼吸和体内相关酶的活性，降低细胞代谢，保持细胞遗传特性[1]。

    1.2 细胞复苏

    解冻程序会显著影响冻存后细胞生存能力和细胞恢复，评估活性和活细胞回收率是评价方法性能的必要条件。解冻时间、洗涤介质、温度、离心时间和离心力等都会影响冻存后细胞的复苏[2]。①复苏温度：通常细胞的冷冻复苏是放在 37 ℃ 水浴中快速化冻，融化到能看见少量冰存在时取出或者直接等冰全部融化。②洗涤液的温度：Ramachandran 等[3]研究将冰冷的洗涤介质直接添加到融化的细胞中与将洗涤介质加热到 37 ℃ 再添加相比，回收的外周血单核细胞(PBMC)的活力和功能明显降低。Disis 等[4]在 PBMC 冷冻保存淋巴细胞保持其功能影响的研究中，洗涤液冷却至 4 ℃ 时，平均生存力仅为(69.7 ± 12.5)%，在 25 ℃ 下为(92.55 ± 3.1)%，在 37 ℃ 下为(95.11 ± 2.5)%，因此，洗涤液预热至 37 ℃ 能更好地保持细胞的活率。③洗涤介质的选择：在洗涤介质中使用胎牛血清时，要考虑批次间生物学差异以及动物来源材料存在的风险。④离心力和离心时间：降低离心力和时间会产生更高的生存力和更低的活细胞回收率 ......