姜舒，王冰，郭霞，张芸，谢亮，罗朝霞，刘赢滢

    ·论著·

    PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究

    姜舒，王冰，郭霞，张芸，谢亮，罗朝霞，刘赢滢

    518000 深圳市茵冠生物科技有限公司(姜舒、王冰、张芸、谢亮、罗朝霞、刘赢滢)；518000 深圳，南方医科大学深圳医院(郭霞)

    构建程序死亡受体 1(PD-1)敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)修饰的嵌合抗原受体 T 细胞(GPC3-PD1gRNA-CART cells)，研究其对肝癌细胞株 HepG2 的体外杀伤作用，以及其对肝癌动物模型的体内抗肿瘤作用。制备 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞，用流式细胞仪检测 PD-1、GPC3 CAR 的表达情况。体外实验中，设立不同的效靶比(1:1、2:1、4:1)，用 LDH 法测定刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞体外对 HepG2 细胞株的杀伤率，检测刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞和 HepG2 细胞株共孵育 18 h 后的细胞培养上清液中 IFN-γ 的释放水平。设置受刀豆蛋白 A 刺激的和未受刀豆蛋白 A 刺激的 GPC3 修饰的 CART 细胞(GPC3 CART cells)作为对照组。于重度免疫缺陷小鼠(NDG 小鼠)皮下注射 HepG2 细胞建立肝癌动物模型，观察 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞体内抑瘤作用。实验分为模型组、实验组(GPC3-PD1gRNA-CART 组、GPC3 CART组)，模型组和实验组通过皮下注射 1 × 106个 HepG2 细胞造模，在肿瘤长径达 3 mm 后实验组经尾静脉注射5 × 106个 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞或 GPC3 CART 细胞，模型组经尾静脉注射 0.9% NaCl，每周注射 1 次，共 3 周，注射体积均为 0.2 ml。每隔 2 天观测肿瘤体积情况，治疗 3 周后取皮下肿瘤组织，HE 染色检测肿瘤组织情况。流式细胞术分析结果显示，GPC3 CAR 表达率为 98.8%。GPC3 CART 细胞 PD-1 的表达率为 11.1%，经刀豆蛋白 A 刺激后，PD-1 的表达率上升至 92.1%，而 GPC3-PD1gRNA-CART 细胞的 PD-1 表达率仅为 60%，证实了 PD-1 有效敲除。当效靶比为1:1、2:1、4:1 时，随着效靶比的增加，刀豆蛋白刺激后的 GPC3-PD1gRNA-CART细胞对 HepG2 的杀伤效果和 IFN-γ 的释放水平也随着效靶比的增加而增加 ......