姜羽，黄星宇，白利平

    ·论著·

    靶向革兰氏阴性菌生物膜的糖苷水解酶挖掘及功能研究

    姜羽，黄星宇，白利平

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室

    挖掘对革兰氏阴性菌生物膜具有抑制和破坏作用，特别是具有跨种活性的糖苷水解酶。利用已有基因组数据，通过序列相似性比对及基因注释分析寻找新型糖苷水解酶，通过基因克隆和蛋白表达纯化获得一系列不同革兰氏阴性菌来源的糖苷水解酶。以靶向铜绿假单胞菌生物膜的糖苷水解酶 PslG31-442作为阳性对照酶，构建靶向铜绿假单胞菌生物膜的药物筛选模型，并进一步构建靶向肺炎克雷伯杆菌生物膜的药物筛选模型。利用自行构建的筛选模型对上述不同糖苷水解酶进行活性筛选。筛选得到一种具有跨种活性的、来自克雷伯菌属糖苷水解酶 19 家族的糖苷水解酶KPGH3。KPGH3 能够有效抑制铜绿假单胞菌 PAO1、PA14 菌株以及肺炎克雷伯ATCC 700603 菌株生物膜的形成，EC50分别为36.85、43.34和 82.58 nmol/L；并能够在 1 h 内有效破坏 3 种菌株形成的成熟生物膜，EC50分别为45.35、29.3 和 18.23 nmol/L。糖苷水解酶 KPGH3 不但能在纳摩尔级浓度抑制多种致病性革兰氏阴性菌生物膜的形成，并能有效破坏上述菌株已经形成的陈旧生物膜，具有潜在应用价值。

    生物膜； 糖苷水解酶； 铜绿假单胞菌； 肺炎克雷伯杆菌； KPGH3

    近年来，生物膜的形成已经被认定为大多数微生物引发感染和耐药的关键因素。人体中约 80%的慢性和复发性微生物感染是由细菌生物膜引起的[1]。生物膜为包裹其中的病原菌提供了许多生存优势，包括但不限于：保护病原菌免受宿主免疫系统和抗菌药物/抗生素的攻击、保存水分、增加微生物对干燥的耐受性、吸收储存营养物质、保持高细胞外酶活性、对感染部位的黏附、细胞聚集、通过群体感应协调毒力因子表达[2-4]。传统治疗细菌感染的方法直接靶向病原菌，但生物膜的存在使抗菌药物的有效浓度提升到了危险水平。此外，包裹在生物膜中的病原菌还可能产生代谢休眠细胞或分子持久性机制对抗药物治疗，这也是导致生物膜类感染在临床治疗停顿一段时间后复发的原因。在 2017 年 WHO 发布的急需研发新型抗生素的重点病原体清单中大部分为革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌由于含有不可渗透的细胞壁，与革兰氏阳性菌相比对抗体和抗生素具有更强的抵御力，具有很高的发病率和死亡率[5]。铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌是最常见的引发临床感染的革兰氏阴性致病菌 ......