朱泽健，张超，曾洁，张传宝

    技术与方法·

    一种高效制备α-L-岩藻糖苷酶的方法和应用

    朱泽健，张超，曾洁，张传宝

    100730 北京，北京医院/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院/国家卫生健康委临床检验中心/北京市临床检验工程技术研究中心/(朱泽健、张超、曾洁、张传宝)；100730 北京，中国医学科学院北京协和医学院(朱泽健、张传宝)

    α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU)[EC 3.2.1.51]是一种外切糖苷酶，从细菌到哺乳动物体内都广泛存在[1]，参与多种基础生化反应。免疫化学交叉反应和纯系化研究显示，不同物种间 AFU 的氨基酸序列与结构十分相似，具有较高的保守性[2]。人体中存在高分子量(约 100 kD)和低分子量(约50 kD)两种形态的 AFU，高分子量的 AFU 是唾液酸糖蛋白，由两个低分子量的单体组成，而低分子量形式是中性的富含甘露糖的糖蛋白，两种形式都可以聚集为四聚体或六聚体形式[3]。人体内的 AFU 广泛分布于各种组织及体液中，如胎盘、胎儿组织、脑、肺、肝、胰、肾，以及血清、尿液、唾液、泪液等。从人脾脏、肝、脑和肾脏中纯化得到的 AFU 具有明显同质性，其中以肝、肾等组织活性较高，细胞内的 AFU 则主要位于溶酶体内[4]。

    AFU 在临床的应用最早开始于对因先天缺乏 AFU 引起的岩藻糖苷贮积病的辅助诊断[5]。自 1984 年 Deugnier 等[6]首次报道肝细胞癌患者血清中 AFU 升高后，关于 AFU 在血清或组织中的活性改变与肿瘤发生的相关性研究也越来越多。检测血清 AFU 联合其他常规检验项目对肝细胞癌、肝内胆管癌等肝脏疾病及其他恶性肿瘤[7-9]的预后以及提高诊断灵敏度、特异度等具有积极意义。

    目前临床上测定 AFU 的方法主要为 2-氯-4-硝基苯- α-L-岩藻糖苷(CNPF)速率法[10]。临床实验室使用的AFU 质控品和参考物质通常从人血清中获得，成本高，产率低。此外，大多数高值 AFU 样本来自恶性肿瘤患者，大大减少了生产来源。因此，从大肠杆菌中表达和纯化更高浓度的 AFU 可为临床实验室提供更优质、更廉价的质控品和候选参考物质。

    本研究构建原核表达质粒 6His-AFU-pRSFDuet，在大肠杆菌中诱导表达并纯化。大肠杆菌是一种应用广泛的表达宿主，它以简单、快速和经济的方式生长，可高效、快速地获取高纯度 AFU。同时，6His 标签能有效地分离目的蛋白质，最终获得完整且具有生物活性的AFU ......