陈虹彤，卢芸，李国庆，李聪然，游雪甫，杨信怡

    作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所抗感染药物研究北京市重点实验室

    细胞色素 P450(cytochrome P450，CYP)酶是一类含有血铁红素的单加氧酶超家族，广泛分布于各级生命体并发挥重要作用[1]。1998年，结核分枝杆菌(M.tuberculosis，Mtb)H37Rv 的全基因组序列图完成，研究者发现在全长 4.4 Mb 的MtbH37Rv 染色体 DNA 中存在 20 个不同的 CYP酶编码基因，其在基因组中的分布密度远高于多数其他原核微生物，这一现象提示 CYP 酶在Mtb中应该发挥着重要的生理功能[2-3]。随后的研究显示，CYP 酶参与Mtb呼吸链电子传递、脂质代谢与合成、胆固醇利用等诸多生理生化过程，对维持细菌生长增殖、细胞膜/壁完整、宿主细胞内持留、致病力、抗生素耐药性等颇为重要[4]。由于Mtb与真核生物间的 CYP 酶基因同源性较低(通常 1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.2 试剂与培养基 胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、LB Broth、Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10 及 OADC 均购自美国 BD 公司；氯化钠、甘油购自生工生物工程(上海)股份有限公司；潮霉素B(hygromycin B，HYG)、吐温 80 购自美国Sigma 公司；胶回收试剂盒 EasyPure?Quick Gel Extraction Kit 、 Trans2KPlusII DNA Marker 、Trans15K DNA Marker 购自全式金生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶、限制性内切酶PacI 购自宝生物工程(大连)有限公司；Fast DigestVan91I、Phusion High Fidelity DNA Polymerase 购自美国Thermo Fisher 公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自美国 Omega 公司；包装试剂盒购自 Epicentre生物技术公司。

    顶层琼脂(100 ml)：Middlebrook 7H9 broth 0.47 g、琼脂 0.75 g，121 ℃ 高温灭菌 15 min；MP 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgSO4、2 mmol/L CaCl2，稀盐酸调至 pH 7.5 或 7.8，0.22 μm 无菌滤器过滤 ......