梁丽，陈驰，石继春，王春娥，龙新星，刘茹凤，黄洋，李康，徐潇，李江姣，徐颖华，叶强

    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为假单胞菌属的一种革兰氏阴性菌，也被称为绿脓杆菌。在自然界水、土壤与空气中均广泛存在[1]。铜绿假单胞菌污染常见于凉拌菜、熟肉制品、饮用水等食品领域。例如在水源水或成品水中检出铜绿假单胞菌，甚至多批次样品的检出率大于 10%，为一种重要的水源和食源性致病菌[2-4]。因此在我国饮用天然矿泉水(GB 8537-2016)[5]和包装饮用水(GB 19298-2014)[6]的国家标准中均明确规定不得检出铜绿假单胞菌。此外，在 2015年我国颁布的《化妆品安全技术规范》也要求化妆品中不得有铜绿假单胞菌检出[7]。铜绿假单胞菌作为医院内感染的主要病原菌之一，在机体免疫力低下时，例如术后和恶性肿瘤的患者容易感染本菌，且铜绿假单胞菌的耐药性强，在治疗时往往需要使用多种抗生素进行联合用药[8-9]。因此，快速而准确地鉴定出铜绿假单胞菌对保障食品安全和人民健康具有重要的意义。

    尽管铜绿假单胞菌为食品、化妆品等微生物常规检测项目之一，但所推荐的检测方法为传统细菌培养法[6]。作为细菌检测“金标准”的细菌培养法，其准确度高，但耗时长、灵敏度较低。随着检测技术的不断发展以及铜绿假单胞菌的全基因信息解析[10]，各种分子生物学技术，包括单一 PCR、多重 PCR、定量 PCR 技术、环介导等温扩增技术等，凭借强特异性、高灵敏度、简便省时等优点，已经被广泛应用在铜绿假单胞菌的检测和研究中[2,11-13]。但至今尚无铜绿假单胞菌相关国家参考品，导致不同企业的产品缺乏统一的标准衡量，不利于行业水平的整体提升。本研究研制了铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒用国家参考品，以期为未来相关定性检测试剂盒的质量控制和评价提供物质基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 10 株不同来源的铜绿假单胞菌标准菌株用于阳性参考品的制备(表1)；用于制备阴性参考品的菌株分别为：嗜麦芽窄食假单胞菌 CMCC(B)10701、恶臭假单胞菌 CMCC(B)10716、荧光假单胞菌 CMCC(B)10711、布氏假单胞菌 CMCC(B)10712、摩氏假单胞菌CMCC(B)10713、金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26001、肺炎克雷伯菌 CMCC(B)46117、肺炎链球菌 CMCC(B)31001、脑膜炎奈瑟菌 CMCC(B)29052、大肠埃希菌 CMCC(B)44113 ......