张志恒，刘建喜

    ·综述·

    NanoLuc的发展及其在药物研发中的应用

    张志恒，刘建喜

    生物发光是生物产生光的一种自然现象。当小分子萤光素被萤光素酶催化氧化，形成发光激发态时，就会出现生物发光的现象。不同的萤光素-萤光素酶具有不同的发光波长，因此适用于不同的需求。在过去十年左右的时间里，蛋白质工程、合成化学和物理学取得了巨大的进步，使得萤光素和萤光素酶的应用得到不断拓展。生物发光反应现在广泛用于基因分析、蛋白质-蛋白质相互作用的检测、药物发现中的高通量筛选(HTS)、卫生控制、生态环境污染分析和小型哺乳动物的活体成像等。

    萤光素酶和相应的底物已被开发并应用了十余年，如萤火虫萤光素酶(firefly luciferase，FLuc)等。NanoLuc 萤光素酶(NLuc)作为最新商业化的萤光素酶[1]已被用于生物医学研究，包括研究蛋白质-蛋白质相互作用、研究遗传调控和细胞信号转导、监测蛋白质表达的稳定性、基于生物发光共振能量转移(BRET)原理的传感器和分子成像。NLuc 萤光素酶具有显著的优点，但与传统萤光素酶系统一样也有其局限性。本文将介绍萤光素酶的种类，重点讨论 NLuc 在药物研发中的应用。

    1 萤光素酶的种类

    1.1 萤火虫萤光素酶

    1985 年，Kricka 和Leach[2]报道了在大肠杆菌中克隆萤火虫萤光素酶，其底物是 D-萤光素，FLuc 与其底物的反应式如图1A 所示。与其他萤光素-萤光素酶系统相比，其优势在于 D-萤光素在氧化前需要被 ATP 激活，它对自动氧化的敏感性更低，在溶液中更稳定，背景化学发光更少。FLuc 作为报告基因的特点是其分子量为 62 kD，蛋白表达在细胞内，发光颜色为黄绿色，半衰期为 3 h，其他特点如表1 所示。

    图1 萤光素酶催化其底物的反应式(A：FLuc 催化其底物的反应式；B：RLuc 和 GLuc 催化其底物的反应式；C：CLuc 催化其底物的反应式；D：NLuc 催化其底物的反应式)

    表1 萤光素酶的种类与特点

    名称底物稳定性可否互补灵敏度多色检测参考文献 萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)D-萤光素(D-Luciferin)(C11H8N2O3S2)++可互补+可用于多色检测[3] 海肾萤光素酶(renilla luciferase)腔肠素(Coelenterazine)(C26H21N3O3)++可互补++可用于多色检测[4-5] 高斯萤光素酶(gaussia luciferase)腔肠素(Coelenterazine)(C26H21N3O3)++可互补+++可用于多色检测[6] 海萤萤光素酶(cypridina luciferase)海萤萤光素(Cypridina luciferin)+ +++可用于多色检测[7] NanoLucFurimazine(C24H19N3O2)+++可互补++++可用于多色检测[1, 8] ......