林茹，李可萌，刘娟娟，戴剑漉，赫卫清

    ·论著·

    螺旋霉素生物合成基因簇中,-二甲基转移酶基因功能的鉴定

    林茹，李可萌，刘娟娟，戴剑漉，赫卫清

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室/医科院合成生物学重点实验室

    确定螺旋霉素(SP)生物合成途径中编码两个,-二甲基转移酶的基因9 和22 的功能，并在基因阻断变株中分离纯化相应的 SP 前体物。利用抗性基因插入或 CRISPR-Cas 基因编辑的方法阻断9 和22 基因，并对其进行基因回复实验。利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用分析变株 Δ9 和 Δ22的发酵产物。利用半制备液相色谱的方法分离纯化缺少甲基化修饰的 SP 前体物，经核磁共振波谱(NMR)数据分析确定其化学结构。成功构建了两个基因的阻断株 Δ9 和 Δ22。Δ9 变株的发酵液没有抗菌活性的物质产生，经 HPLC-MS 分析也未发现相应的 SP 前体物。而 Δ22 变株的发酵产物的抗菌活性下降 50% 以上，从 Δ22 变株发酵产物中分离出福洛胺糖缺少两个甲基的 SP 前体物。22 基因负责 SP 生物合成中福洛胺糖上的,-二甲基的催化，而9基因可能参与麦洛胺糖的,-二甲基化修饰，且两者在功能上不能互补。

    螺旋霉素；,-二甲基转移酶基因； 基因阻断

    螺旋霉素(spiramycin，SP)是一种大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics，MA)，它的主核是一个16 元内酯环，其上连有 3 个脱氧糖，分别是 2 个氨基糖——福洛胺糖、麦洛胺糖和 1 个中性糖——麦洛糖，这些糖基是 SP 抗菌活性的关键基团(图 1)。MA 属细菌生长期速效抑菌剂，一般无过敏性反应，口服吸收好，服用方便。许多半合成改造后的 MA 在胃肠道中的稳定性好，组织分布广，体内持续时间长，但生物利用率较低，胃肠道反应比较大。然而，16 元环的 SP 没有其他 MA 所致的肝损害，对胃肠道的反应也小于 14 元环 MA[1-5]。MA 是通过与细菌 50S 核糖体结合而抑制其蛋白质合成。与 14 元环相比，16 元内酯环上多了 2 个碳原子、C3 位没有糖基、C5 上有两个糖基，特别是 SP 在 C9 位有一个福洛胺糖，这些结构上的差异导致其与核糖体大亚基的结合位点也不同。C5 位较长的糖基侧链能干扰到蛋白合成中的肽酰基转移酶反应，最终引起抑制活性不同。此外，药物在组织中的渗透性对于药物的作用十分重要。螺旋霉素类药物在体内能迅速而广泛地分布至组织 ......