张影，石刚，李彬，杜宗利，辛晓芳，徐颖华

    钩端螺旋体(简称钩体)属按照致病性不同可分为问号钩体和腐生性钩体，前者主要分离于病人和动物，具有寄生性；而腐生性钩体通常对人或动物不致病，常存在于环境土壤和水中[1]。人感染钩体病主要通过直接或间接接触了受问号致病性钩体污染的水、土壤或带菌动物的尿液。据统计报道每年全球仍有约 200 万钩体感染病例，其中大多数来自热带及亚热带地区的发展中国家和不发达国家，给当地人民健康和畜牧业生产造成了严重的影响[2-3]。为了更好预防和控制该传染病，国内外学者一直致力于研究钩体病的快速和早期诊断，例如建立了以腐生性钩体 Potoc 菌株为抗原的玻片凝集试验，并被证实该方法对钩体病的诊断具有一定帮助[4-5]，但其方法内在机制尚未完全清楚。为了进一步了解其内在分子机制，本研究将腐生性钩体Potoc 菌株灭活菌液与国内 15 种不同血清群致病性钩体代表菌株血清进行免疫印迹分析，同时对Potoc 菌株进行全基因组测序，分析菌株的全基因组特征，并与已公布不同基因种的致病性钩体进行比较基因组学分析，构建系统发育树，从而为解析钩体属不同种基因组多样性和进化等研究提供新的线索。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 腐生性钩体 Potoc 型菌株(65-15)来源于中国食品药品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心。

    1.1.2 主要仪器和试剂 细菌培养箱为北京中仪国科科技有限公司产品；Vitek 全自动微生物鉴定仪为梅里埃诊断产品(上海)有限公司产品；EMJH培养基为美国 BD 公司产品；DNA 提取试剂盒为德国 Qiagen 公司产品；国内 15 种不同血清群致病性钩体代表菌株的兔血清来源于中国食品药品检定研究院；其他试剂均为国产分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 细菌培养 将腐生性钩体 Potoc 菌株接种至含 10% EMJH 培养基中，28 ℃ 培养 7～10 d，收集菌体；同时按照 DNA 试剂盒推荐操作步骤，提取菌株全基因组 DNA，DNA 样品放置于 -70 ℃保存备用。

    1.2.2 全基因组序列测定与生物信息学分析 应用 Solexa 测序技术进行全基因组测序，并分别使用生物信息分析软件 velvet 1.2.03 和 glimmer 3.02 对获得下机数据进行拼装和基因预测 ......