刘向东，钱军华，王威

    自 1986年全球首个单抗药物批准上市以来，经过30 多年的发展，单抗目前已成为全球生物制药增长最快的细分领域。近年来我国的抗体药物也有了迅速的发展，截至2021年 11月，已批准上市的国产单抗药物数量达 31 个[1]。生产中单抗药物主要通过基因工程技术构建表达质粒并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO 细胞)，经 CHO 细胞生长培养表达所需蛋白并纯化获得抗体原液，最后制剂灌装得到单抗成品。为了更好地保护蛋白的稳定，保证原液的质量，延长有效期，抗体原液一般都选择低温冷冻保存，灌装时重新解冻后使用。有研究显示抗体原液在冻融过程中，在-5 ～ 0 ℃ 时发生相变(固液两态转化)，形成冰晶体，内部溶质产生冷冻浓缩，酸碱度失衡，局部 pH 值及离子强度发生变化，蛋白发生聚集[2-4]。抗体的聚集大多都是不可逆的，有学者提出了抗体聚集物有可能通过两种途径使正在接受抗体类药物治疗的患者产生免疫原性：T 细胞依赖途径以及细胞因子激活途径，而且分子量越大的聚集物其免疫原性越强，最终，免疫原性反应不仅大幅降低了药物体内的疗效，而且易引发 I 型超敏反应[2]。因此有必要针对抗体原液冻融过程稳定性及影响因素进行研究，以及建立稳定的原液冻融工艺，指导生产。

    以公司在研的单抗产品为例，参照《中华人民共和国药典》2020年版(ChP 2020)四部中“生物制品稳定性试验指导原则”，通过缩小模型实验探究固有因素和可变因素在冻融过程中对原液蛋白稳定性的影响。固有因素包括分子类型和蛋白浓度；可变因素包括原液的包装形式、包装规格和冻融条件。因对目标函数(蛋白质量)没有充分的实验数据分析和预判，所以选择单因素“优选法”(即斐波那契法)进行实验设计，每个实验因素包含不同的水平。实验结束后通过不同的策略组合，运用统计学原理分别以横向与对照品(未经冻融的样品)进行比较，纵向与不同分子类型、蛋白浓度、包装形式、包装规格以及冻融条件进行比较，以探讨抗体原液冻融过程稳定性。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验样品 选用 5 种抗体原液，分别为原液 1(蛋白浓度：50 mg/ml，IgG1 野生型)、原液 2(蛋白浓度：10 mg/ml，IgG1 突变型)、原液 3(蛋白浓度：50 mg/ml，IgG1 突变型)、原液 4(蛋白浓度：150 mg/ml，IgG1 突变型)、原液 5(蛋白浓度：50 mg/ml，IgG4 突变型)，均为本公司产品。

    1.1.2 仪器和设备 -60 ℃ U410-86 型超低温冰箱为德国Premium 公司产品；34970A 型多路温度记录仪购自安捷伦公司；所用材料：冻存瓶(规格：125 ml、500 ml 和1000 ml ......