田亚宾，沈舒，周海卫，许四宏

    ·技术与方法·

    第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品的研制

    田亚宾，沈舒，周海卫，许四宏

    100050 北京，中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室

    人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一个小的环状双链-DNA 病毒，属于乳头瘤病毒家族。主要感染皮肤、生殖器和上呼吸道的表皮细胞。目前，大约 200 多种 HPV 型别被鉴定发现[1]。HPV 的基因组长约为 8000 bp，主要分为三个区：早期基因、晚期基因和长调控区。早期基因编码 6 个早期蛋白，包括 E1、E2、E4、E5、E6 和 E7，主要负责病毒的转录和复制。其中，E6 和 E7基因编码与细胞癌变转化相关的蛋白。晚期基因 L1 和 L2 主要负责编码衣壳蛋白[2]。根据其与癌症的相关性，分为高危型 HPV(HR-HPV)和低危型 HPV(LR-HPV)。目前，将 14 种 HPV 型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)定为 HR-HPV，4 种 HPV 型别(26、53、73、82)列为潜在 HR-HPV。HR-HPV的持续性感染是造成宫颈癌及多种生殖道癌症的主要病原体。在中国，69.1% 的宫颈癌病例为 HPV16 和 HPV18 感染，14.7% 为 HPV31、33、52、58 和 59。HPV39、45 和 56 占宫颈癌的 4.5%，剩余的病例是比较少见的其他型别，如 HPV66[3]。

    由于 HPV 在体外无法分离培养，血清学方法检测 HPV 的灵敏度较低。在临床上，主要通过检测核酸诊断 HPV 感染。国内外已有众多商品化 HPV 核酸检测试剂，这些试剂采用的方法学繁多，包括 PCR 荧光法、PCR 反向杂交法、基因芯片法、恒温扩增法、杂交捕获法、测序法等[4-5]。大多数试剂基于高度保守的 L1 区，还有少数试剂集中于 E1、E2、E6、E7 区。目前，国内已研制成功人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品，由于 HPV DNA 的量值为参考范围(106～ 107copy/ml)且未覆盖 HPV51、HPV53 和 HPV56 高危型别样本，故在实际应用中存在一定的局限。本研究旨在更新和完善人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品，更好地适用于该类试剂的质量控制和评价。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    23 种不同型别的 HPV 全基因组质粒由亚能生物技术(深圳)有限公司提供；5 株 HPV 阴性的病原体分别为巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒1 型(HSV-1)、沙眼衣原体(CT)、B 族链球菌(GBS)和解脲脲原体(UU) ......