柴欣楼 王 伟 王绿娅 张永生

    (1北京中医药大学，北京市朝阳区北三环东路 11号，100029;2北京市安贞医院)

    冠脉形成术造成了血管内皮细胞损伤，加速了血栓的形成。附壁血栓的形成，不仅造成血管的急性闭塞，而且为平滑肌细胞 (vessel smooth musle cell，VSMC)的内迁提供了框架，增殖的 VSMC由血管中层向内膜的迁移是内膜增厚的一个重要机制。在此过程中，细胞边缘存在大量基质金属蛋白酶(maxtrix metalloproteinases，MMPs)和纤维蛋白溶解酶，这 2种物质可降解细胞外基质，加速 VSMC的迁移[1]。VSMC迁移的结果可导致内膜中 VSMC的大量积聚和结缔组织的形成，进而促进新生内膜形成。

    葛根素(Pur)为异黄酮类化合物，属于植物雌激素。现代药理研究证明 Pur在心血管中具有多种功能，可扩张心、脑血管，降低血黏度，抑制血小板活性，降低血小板黏附率;可对抗 H2O2引起的无血清培养的 VSMC凋亡及坏死[2]。

    本研究以葛根素为研究对象，构建 VSMC迁移模型，Boyden小室法检测 VSMC的迁移，ELISA法检测MMP-2、MMP-9的含量，在此基础上采用明胶—聚丙烯酰胺电泳酶谱分析 VSMC分泌 MMP-2的活性。

    1 材料与方法

    1.1 材料与分组 1)主要试剂:DMEM培养液(美国GIBCO公司产品)，胎牛血清 (FBS，Hyclone公司产品)，凝血酶(冻干粉，美国 Sigma公司产品)，葛根素原粉(纯度 99.7%，由卫生部药品生物制品鉴定所提供)，MTT、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶和 EDTA、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物制品有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国 Bio-Rad公司)，MMP-2、MMP-9 ELISA试剂盒(鼎国试剂公司)。2)VSMC体外培养及鉴定:常规组织贴块法培养VSMC。实验用 4～8代细胞。用光镜和免疫组化方法进行鉴定。3)药物配制及梯度稀释。4)葛根素原粉，选择二甲基亚砜为溶剂，配制浓度分别为 10mM和1mM。将 1mM药物溶液用溶剂以 1:10的比例进行梯度稀释，使最终药物浓度从 1mM变化到 1nM。5)分组。正常对照组:用含 1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。模型组:加终浓度为 5u/L凝血酶的 1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞。葛根素组:加终浓度为5u/L凝血酶和浓度为 10-2mol?L-1的葛根素溶液的1%小牛血清 DMEM培养液培养细胞 ......