重庆云阳橘红褐斑病病原鉴定及生物学特性初步研究(2)
1.1.2 病原菌鉴定 光学显微镜下观察叶片及果实病斑和分离获得的疑似病原菌菌丝及分生孢子的形态特征。观察、测量菌落在PDA平板上的生长情况。根据镜检特征及菌落形态,进行病原菌的初步鉴定。1.2 病原菌的分子鉴定 提取病菌基因组DNA,采用通用引物ITS1/ITS4进行分子鉴定。PCR扩增体系及条件如下:25 μL体系;模板DNA,2 μL;2Master Mix(天根,北京,中国)12.5 μL;引物各1 μL;dd H2O补足至25 μL。扩增条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,共35个循环;最后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小。PCR扩增产物经用胶回收试剂盒(Axygen,北京,中国)回收后与pEASY-T载体(Takara,大连,中国)连接,蓝白斑筛选阳性克隆,经培养后使用PCR进行验证。将验证的阳性克隆送北京华大生物技术有限公司测序。将测序获得序列在NCBI的nt数据库中进行blastn搜索。采用Mega 4.0统计软件[10] ......
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