焦 存 杨丽晓 张 艳 王 哲 李亦晗 芦现杰

    (1 山东省聊城市人民医院,聊城,252000; 2 山东大学附属聊城人民医院,聊城,252000; 3 山东中医药大学,济南,250355)

    卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)是指女性在40岁以前出现闭经、促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,常伴有不同程度的围绝经期症状。中医辨证多与肾虚有关。左归丸始于《景岳全书》,是中医补肾的经典方剂,具有滋阴补肾、填精生髓的功效,近年来广泛应用于卵巢早衰等生殖疾病的治疗[1]。干细胞具有多向分化的特性,人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)作为组织损伤修复与再生的理想种子细胞之一,在治疗卵巢早衰方面亦得到大量研究[2-3]。左归丸和hUC-MSCs相结合为卵巢早衰治疗提供了新的思路。研究发现,干细胞归巢率低等问题严重制约其治疗效果,基质细胞衍生因子-1(Stromal Cell-derived Factor-1,SDF-1)/C-X-C趋化因子受体4(C-X-C Chomekine Receptor 4,CXCR4)信号通路在间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)迁移和归巢中发挥着关键作用[4-5]。左归丸可能通过调控骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的体内迁移与归巢从而增强其治疗效果[6]。但是,关于左归丸对hUC-MSCs体外迁移作用及与CXCR4表达关系的研究,国内外鲜见报道。因此,本研究拟探讨左归丸对hUC-MSCs体外迁移的影响及可能的分子机制,以期为左归丸联合hUC-MSCs治疗卵巢早衰提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞 hUC-MSCs,采用组织块法分离培养健康产妇足月分娩胎儿的脐带样本,经聊城市人民医院伦理委员会批准(伦理审批号:2019016)。培养液为DMEM/F12培养液(含10% FBS和1%双抗),条件为37 ℃和5%CO2。

    1.1.2 药物 左归丸(仲景宛西制药股份有限公司,批号:181012)。

    1.1.3 试剂与仪器 杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(Dulbecco′s modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(货号:11330032)、青霉素-链霉素(货号:15140122)、TrypLE酶(货号:12605010),以上均购自美国Gibco公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(ScienCell公司,美国,货号:0510);普乐沙福(AMD3100)(MCE公司,美国,货号:HY-10046);CD34抗体(货号:348057)、CD45抗体(货号:555483)、CD73抗体(货号:561014)、CD90抗体(货号:555595),以上均购自美国BD公司;PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara公司,日本,货号:RR036A);SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher公司,美国,货号:4309155);结晶紫染色液(货号:E607309)、一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒(货号:C500022)、改良BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(货号:C503051)、ECL超敏化学发光试剂盒(货号:D601039),以上均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;CCK-8试剂盒(货号:C0037)、SDF-1α(货号:P6537)、QuickBlockTMWestern溶液套装(货号:P0239)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(货号:A0216),以上均购自碧云天公司;β-actin抗体(货号:sc-47778)、CXCR4抗体(货号:sc-53534)、CXCR4-FITC抗体(货号:sc-53534 FITC),以上均购自美国Santa Cruz公司 ......