赵学峰，罗丽贞，区云枝

    (南方医科大学附属南海医院，广东佛山 528200)

    乳酸菌(lactic-acid bacteria)广泛存在于人、畜、禽的肠道，能够调节机体胃肠道正常菌群生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素、肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应急反应等产生作用。目前，已有众多文献报道利用乳酸菌作为载体表达外源基因，进行疾病的防治；但传统的乳酸菌表达载体为保持一定的选择压力，大多带有1个或多个编码特定抗生素抗性的基因(如红霉素抗性基因等)，存在潜在的抗生素耐药性播散的危险。

    细菌的营养缺陷型是指细菌的某些基因如管家基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应，这些基因突变或缺失后，不能合成相应产物，导致细菌在外界环境中或基本培养基上不能生长，需要补充相应的底物。胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，ThyA)基因编码胸苷酸合成酶，在DNA合成中起关键作用，缺失ThyA基因的菌株在基本培养基上不能生长；染色体整合是一种有效的改造微生物的手段，插入序列、转座子和同源重组是染色体整合的通常形式，其中同源重组的特点是能够按人们所预期的基因位置进行染色体整合[1-2]。

    因此，本研究拟利用细菌营养缺陷型互补和同源重组的原理，构建一个可应用于乳酸菌的同源重组载体。利用该同源重组载体可将目的基因整合于消化道共生乳酸菌染色体中，实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达，为构建能高效、安全分泌表达外源目的基因的转基因乳酸菌奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、质粒、培养基和生长条件

    大肠埃希菌 DH5α、乳酸乳球菌 MG1363(Lactococcus lactis MG1363)、质粒 pMUTIN4[3]由本室保存。DH5α 常规培养用LB培养基，37℃振荡培养；乳酸菌常规培养在GM17培养基(M17培养基，0.5%葡萄糖)，30℃静止培养。氨苄青霉素在E.coli培养中的浓度为 100 μg/ml。

    1.1.2 主要试剂和材料

    高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DL2000 Marker、限制性内切酶均购自大连Takara公司；M17购自Oxoid公司；质粒抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒购自Sigma公司；引物委托上海英俊公司合成 ......