郑毅雄，张鲁清，包 祺，陈 奇，姜 明，陈 力

    (浙江大学医学院附属第二医院外科，浙江杭州 310009)

    全胃切除的患者常常会出现倾倒综合征、反流性食管炎、营养不良和贫血等问题，使得患者的生活质量下降。尽管各种胃替代手术方法被用于临床中，但是重建方式的有效性仍颇受争议。新近的组织工程技术使得胃肠道的人工再造成为可能，研究表明，利用种子细胞、支架材料以及相应的生长因子构建有生物活性的胃肠道，能够增加胃肠黏膜吸收面积，改善胃肠道功能[1-2]。因此，利用组织工程技术在体外形成胃组织进行体内再植，为解决全胃切除术后的营养吸收问题带来了希望。

    胃肠道平滑肌层对于胃肠的蠕动功能和病理生理机制具有十分重要的作用。因此，获取大量高纯度的胃肠平滑肌细胞是胃肠组织工程学的必要条件。本研究在显微镜下分离大鼠胃平滑肌，采用酶消化法获取平滑肌细胞，建立稳定的胃平滑肌细胞体外扩增培养模型，并进一步探讨其三维复合培养的可行性，从而为开展相关的组织工程研究打下良好的基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及主要材料

    150～200 g SD大鼠由浙江大学动物实验中心提供，PLGA支架材料由浙江工业大学冯杰教授提供，高糖DMEM培养液(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物技术研究所)，胰蛋白酶(Gibco公司)，Ⅰ型胶原酶(Sigma 公司)，Tissucol凝血酶和纤维蛋白原(Baxter公司)，兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，碘化丙啶(PI)(Sigma 公司)，二乙酸萤光素(FDA)(Sigma 公司)，5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)(Sigma公司)，恒温二氧化碳细胞培养箱(Heraeus公司)，倒置显微镜(IX70，Olympus公司)，荧光显微镜(PROVIS AX70，Olympus公司)。

    1.2 大鼠胃平滑肌细胞的分离和培养方法

    无菌条件下剪取大鼠胃底，将剪下后的组织立即置于含青、链霉素的无菌Hanks液中，移入超净工作台内反复漂洗2～3次，在体视显微镜下仔细去除食物残渣及内膜，翻转至外侧，小心地撕去肠系膜，再仔细地刮去浆膜层，直至余下的组织层在显微镜下观察到呈透明的一层为止 ......